非小细胞肺癌组织中miR-92a、miR-196b表达水平及其临床意义

彭艳艳 李 聪 张欣宇

肺癌是我国发病率和死亡率均居首位的呼吸系统恶性肿瘤，其发病主要与严重环境污染、高龄、吸烟等因素密切相关[1]。非小细胞肺癌(non small cell Lung cancer,NSCLC)在肺癌患者中占80%左右[2]，该病早期无特异性表现，临床上绝大多数患者确诊时大多数已属晚期，增加了临床治疗难度。微小核糖核酸是机体代谢分子群中新近发现的生物活性RNA分子，具有高度保守性、组织特异性等特点，可在不同疾病人群的血清和组织中呈特异性和稳定表达，与癌症患者的诊断、病理分型、预后等具有重要联系[3]。其中微小核糖核酸-92a(microRNA-92a,miR-92a)是1种重要的促癌基因，其在肺癌组织中的高表达与化疗敏感性及不良预后有关[4]；微小核糖核酸-196b(microRNA-196b,miR-196b)是已被研究证实与结直肠癌、宫颈癌、胃癌等多种恶性肿瘤的发生、发展和转移联系紧密的1种促癌基因，可能与NSCLC患者的不良预后有关[5]。目前对于miR-92a和miR-196b在NSCLC中表达及预后的相关文献鲜少有见报道，基于此，本研究分析了NSCLC患者癌组织中miR-92a和miR-196b的表达水平及其与预后的关系，以期为临床NSCLC预后的评估与改善提供一些理论参考，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料

回顾性选取2015年6月至2017年12月期间于我院经手术治疗的120例NSCLC患者作为研究对象，对其临床资料和癌组织标本进行回顾性分析。120例患者中男性84例，女性36例，年龄35～82岁，平均年龄(60.72±12.46)岁；病理证实腺癌68例，鳞癌48例，其他癌4例。纳入标准：①结合影像学检查、实验室检测等，所有患者均符合NSCLC的诊断标准[6]，并经病理组织学检查确诊为NSCLC者；②均行手术切除治疗，并保存癌组织标本者；③术前未接受放、化疗或分子靶向治疗者；④均完成2年随访，且具备完整的临床及随访资料者。排除标准：①合并严重肝肾功能障碍、代谢性疾病者；②合并其他恶性肿瘤、严重心脑血管疾病者；③精神异常、认知障碍患者。选取NSCLC组织本研究在获得医院伦理委员会审核批准后实施，研究内容设计符合《世界赫尔辛基宣言》。所有患者癌组织标本均在标准手术切除后半小时内经无菌、无核酸酶水冲洗，并放入液氮中，冷冻保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 随访方案 随访从患者切除手术后首日开始，采用门诊随访以及电话随访的方式对入组患者进行追踪，详细记录患者肿瘤的复发、转移情况，随访至术后2年。

1.2.2 分组方法 以患者随访两年内出现的复发及转移情况表示为预后不良，肿瘤复发指影像学显示肺部出现新发病灶；转移指临床及影像学检查显示有淋巴结或远处器官转移，复发及转移病灶均经病理检查进行诊断确诊[7]。将所有入组患者按照随访期间有无复发转移分为两组：有局部复发或远处转移的预后不良组和无局部复发及远处转移的预后良好组。

1.2.3 miR-92a、miR-196b的实时荧光定量PCR检测 取两组患者冻存的组织标本，于液氮中研磨至粉末状，参照Trizol试剂(Invitrogen公司)总RNA提取试剂盒的规定步骤提取总RNA，即刻逆转录成cDNA用于扩增。选RUN6为内参照(Ribo Bio公司)，采用美国ABI公司7500实时荧光定量PCR仪，其中miR-196b引物序列为：上游5'-TAGGTACCACTTTATCCCGTTCACCA-3'；下游5'-ATCTC GAGGCAGGGAGAGAGGAATAA-3'；miR-92a引物序列为：上 游 5'-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3'，下游5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'；U6引物序列为：上游5'-CTC GCTTCGGCAGCACA-3' ；下游 5' -AACGCTTCA GAATTTGCGT-3'。

经过35个循环扩增后，获得CT值。以2-△CT表 miR-92a和miR-196b的相对表达量，其中△Ct = miR-92a(或miR-196b)平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3 统计学处理

应用SPSS 20.0软件对实验数据进行分析，本研究中涉及的计数资料用%表示，采用χ2检验；计量资料采用“Mean±SD”表示，两组间比较采用两样本t检验，多因素分析采用Logistic回归模型；通过ROC曲线分析miR-92a、miR-196b对NSCLC患者预后的预测价值；对符合正态分布的两数据采用Pearson进行相关性分析，均以P<0.05提示为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者预后情况

在120例NSCLC患者中有62例患者出现复发转移，复发转移率为51.67%，为预后不良组；58例未出现复发转移，为预后良好组。预后不良组中出现肿瘤复发35例，淋巴结转移12例，肺内转移9例，肾上腺转移6例。

2.2 两组患者癌组织中miR-92a、miR-196b表达水平比较及相关性

经实时定量RT-PCR检测后，预后不良组癌组织中miR-92a、miR-196b的相对表达量明显高于预后良好组(P<0.05)，见表1。经Pearson相关性分析结果显示，miR-92a与miR-196b的表达存在明显的正相关性(γ=0.479，P=0.005)。

表1 两组癌组织中miR-92a、miR-196b表达水平比较

2.3 NSCLC患者预后不良的单因素分析

单因素分析结果显示，两组在年龄、性别、肿瘤直径、病理组织学类型及术后是否行放化疗方面比较无明显差异(P>0.05)，两组在肿瘤TNM分期、术前淋巴结转移、癌组织miR-92a表达和癌组织miR-196b表达方面存在明显差异(P<0.05)，见表2。

表2 两组患者肺血管炎的单因素分析(例，%)

2.4 影响NSCLC患者预后不良的多因素Logisitic回归分析

以NSCLC患者术后是否出现预后不良作为因变量，将单因素中差异存在统计学意义的因素(肿瘤TNM分期、术前淋巴结转移、癌组织miR-92a表达和癌组织miR-196b表达)作为自变量，并进行赋值，肿瘤TNM分期(Ⅰ期～Ⅱ期=0，Ⅲ期～Ⅳ期=1)、淋巴结转移(无=0，有=1)、癌组织miR-92a表达(<3.0=0，≥3.0=1)、癌组织miR-196b表达(<3.3=0，≥3.3=1)，并将其纳入Logisitic回归模型中，结果显示TNM分期为III期～IV期、术前有淋巴结转移、癌组织miR-92a≥3.0和癌组织miR-196b≥3.3是NSCLC患者出现预后不良的独立预测因素，见表3。

表3 影响NSCLC患者预后不良的多因素Logisitic回归分析

2.5 单项指标预测与联合预测NSCLC患者预后不良的ROC曲线分析

ROC曲线分析结果显示，癌组织中miR-92a、miR-196b表达量单独预测NSCLC患者预后不良的ROC曲线下面积分别为0.718和0.736，均低于两指标联合预测NSCLC患者预后不良的ROC曲线下面积0.804(P<0.05)；且癌组织中miR-92a、miR-196b表达量单独预测NSCLC患者预后不良时的截断值分别为：3.092和3.855，见图1，表4。

图1 癌组织中miR-92a、miR-196b表达量单项预测与联合预测ROC曲线

表4 癌组织中miR-92a、miR-196b表达预测患者预后的ROC曲线AUC值

3 讨论

随着分子生物学技术的发展，微小核糖核酸的发现为NSCLC的诊断与预后评估提供了新的思路，亦越来越受临床关注。微小核糖核酸是具有调控基因表达功能的生物活性RNA分子，在不同疾病人群的血浆和组织中呈现不同的表达水平，因其的组织特异性和稳定性优势，常作为肿瘤疾病诊断和预后的生物学标志物[8-9]。miR-92a、miR-196b均是与NSCLC癌细胞增殖、分化、凋亡关系密切的微小核糖核酸分子，参与NSCLC的发生、侵袭及转移过程。本研究研讨miR-92a与miR-196b在NSCLC癌组织中的表达水平及其与预后的关系，对于临床上指导NSCLC患者术后的早期预防与控制具有重要作用。

本研究通过半定量RT-PCR法检测得出预后不良组癌组织中miR-92a、miR-196b的相对表达量明显高于预后良好组，可见miR-92a、miR-196b在NSCLC预后不良患者癌组织中呈较高表达，与国内的研究结果较为一致[10-11]。本研究中，NSCLC预后不良的单因素及多因素分析结果显示，TNM分期为III期～IV期、术前有淋巴结转移、癌组织miR-92a≥3.0和癌组织miR-196b≥3.3是NSCLC患者出现预后不良的独立预测因素。可见，miR-92a、miR-196b在癌组织中的高表达与NSCLC术后出现复发和转移具有重要联系。术前TNM分期为Ⅲ期～Ⅳ期以出现淋巴结转移均提示NSCLC患者已处于癌症的中晚期，病情严重程度较重，肿瘤的恶性程度较高，此类患者经手术治疗后往往容易出现复发或转移，导致预后较差。miR-92a是miR-17-92家族中的重要成员，在前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织呈异常表达，参与肿瘤的发生和发展过程。高表达miR-92a对NSCLC患者术后复发或转移的影响机制可能在于：①靶向与调控人体抑癌或促癌基因的表达，进一步发挥促癌作用。国外学者Tsuch-ida等[12]在研究报告中指出，miR-92a能通过靶向调控Bcl-2家族因子的表达发挥促进结肠癌组织中癌细胞的凋亡；还有研究表明[13]，过表达的miR-92a可通过对抑癌基因p53家族成员deltanp63beta表达的调节，发挥促进肺癌细胞增殖并抑制癌细胞凋亡的作用；②高表达miR-92a可能通过降低化疗药物的敏感性影响NSCLC患者预后。宋先璐等[14]研究发现，miR-92a可降低肺癌细胞对顺铂敏感性而增加其对化疗药物的敏感性，使患者手术治疗后即使进行放化疗治疗，亦出现复发或转移，导致预后较差。miR-196b是位于人类7号染色体上的微小核糖核酸因子，可通过与不同的靶基因结合发挥抑癌或促癌作用[15]。肺癌组织中高表达的miR-196b对患者不良预后的影响主要认为与其对癌细胞迁移、侵袭促进作用有关。Liao等[16]在研究高表达miR-196b对胃癌细胞迁移和侵袭的影响结果中发现，miR-196b主要通过结合具有抑制肿瘤作用的转录因子ETS2而发挥促进癌细胞转移的作用。因此，癌组织中miR-92a、miR-196b的较高表达均会增加NSCLC患者术后出现复发或转移的风险，导致预后不良，进一步可说明两指标之间互为正相关关系，这与本研究中miR-92a、miR-196b的相关性分析结果一致。

本研究结果显示，癌组织中miR-92a、miR-196b表达量单独预测NSCLC患者预后不良的ROC曲线下面积均低于两者联合预测的ROC曲线下面积，表明癌组织中miR-92a、miR-196b的联合检测对于NSCLC患者预后的预测价值更高，可作为预测NSCCL患者不良预后的新指标，具有较好的应用价值。

综上所述，miR-92a、miR-196b在NSCLC预后不良患者癌组织中呈高表达，并互为正相关性；二者联合检测对于临床上预测NSCLC患者预后具有较好的应用价值，可作为预测NSCCL患者不良预后的分子标志物。因而临床上可通过联合检测患者癌组织miR-92a、miR-196b水平以筛选手术后预后不良的高风险人群，并尽早采取控制措施，以改善患者预后。