樱花化学成分及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

*卫 强，刘瑞杰，刘 娣，魏灿灿

（安徽新华学院药学院，安徽，合肥 230088）

樱花(Cerasua serrulata)为蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)植物，在世界各地都有栽培，具有很高的观赏价值[1]。据报道，在日本国，其花、叶、汁均可食用，将其加工成樱叶汁，清香扑鼻。每年的三四月份，日本樱花盛开。每到春天，人们信手采来最新鲜的叶子晾干，再放到密封瓶子里保存。还有些主妇，索性将新鲜樱花叶子冷冻起来，以便随时取出制作樱花饼或樱花粥[2]。樱花中富有高膳食纤维、高钾、高钙、高铁，具有较高的营养价值[3]。樱花中还含有多糖、黄酮、绿原酸和挥发油成分[4-5]，平均绿原酸含量高于菊花和桂花，挥发油中硅氧烷类物质用于化妆品和身体护理产品[6]。

樱花同种可开放红色和白色两种颜色的花，其颜色各异，化学成分也有所不同。本研究以黄酮、多糖、色素成分为研究对象，比较樱花中红花和白花多糖、黄酮和色素成分的含量及抑制α-葡萄糖苷酶活性，为其资源开发和利用提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器：紫外分光光度仪（尤尼柯仪器有限公司），超声波提取器（广州万程微波设备有限公司），1260 型高效液相色谱仪（美国Angilent 科技有限公司），TJ270-30A 红外光谱仪（天津拓普仪器有限公司）等。

材料：樱花采自安徽新华学院校园内。高效液相色谱用试剂为色谱纯，所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮含量的比较

精密称量芦丁对照品5 mg，置于100 mL 容量瓶，加乙醇溶解并定容，得浓度为50 μg/mL 的芦丁标准溶液。分别吸取上述溶液1、2、3、4、6、8、12 mL 于25 mL 量瓶中，加入0.5 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min，再加入0.5 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min 后再加入4 mL 2%氢氧化钠溶液，摇匀，放置15 min。以相应试剂为空白，于510 nm 波长下测定吸收度，绘制标准曲线，得回归方程为：A=0.0286C+0.0121，r=0.9992。

取红色和白色樱花50℃烘干，各精密称取5 g，加入80%乙醇200 mL，回流提取各3 次（第一次2 h，第二次1 h，第三次0.5 h），合并提取液。吸取提取液5 mL，加水15 mL，再加入石油醚20 mL，萃取3 次，水层保留，取水层1 mL，置25 mL 量瓶中，测定含量。

1.2.2 多糖含量的比较

精密称量干燥至恒重的葡萄糖50 mg，加水溶解，转移至500 mL 容量瓶，加水定容至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.1 mg/mL 的标准溶液。再吸取0.5、1、2、3、5、7 mL 分别置于10 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，配成浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7 mg/mL 的对照溶液，备用[7]。

准确量取蒸馏水2 mL 和上述葡萄糖对照溶液各2 mL，置于干燥的具塞试管，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，置于冰水中，然后立即加入浓硫酸5 mL，摇匀，放置15 min 置于100℃沸水中加热15 min，取出，再置于冰水中放置15 min，以蒸馏水溶液作空白，于490 nm 处测定吸收度。以质量浓度为横坐标，以吸收度为纵坐标，标准曲线回归方程为：A=9.128C+0.014，r=0.998[7]。

取1.2.1 项下药渣，加200 mL 水，回流提取3次（第一次3 h，第二次2 h，第三次1 h），合并提取液。取提取液20 mL，以Sevage 法除去蛋白质后测定含量。

1.2.3 色素成分提取与比较

1.2.3.1 色素的提取

以水、甲醇、无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇（1:1）、氯仿-甲醇（1:1）、氯仿、石油醚各30 mL 超声提取10 min，不过滤，倾倒入试管中，观察其颜色，以白花和红花原色为标准，选择提取溶剂。

1.2.3.2 色素显色反应

将所得色素取适量移入试管，分别滴入10%氢氧化钠或氢氧化钾溶液、5%碳酸钠溶液、5%三氯化铝乙醇溶液、2%乙酸镁甲醇溶液、2%三氯化铁乙醇溶液、2%铁氰化钾溶液-2%三氯化铁溶液、2%硼氢化钠甲醇液、盐酸-镁粉、5%香草醛-盐酸溶液，记录所呈颜色[8]。

1.2.3.3 色素紫外光谱（UV）分析

以乙醇为空白溶剂，对红色、白色樱花中色素进行紫外扫描。

1.2.3.4 色素高效液相色谱（HPLC）比较

将红色、白色樱花的乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙醇（1:1）超声提取液过0.45µm 有机相滤膜滤过，进行HPLC 测试，流动甲醇（B）-水（A）梯度洗脱：0～10min，90%～10%，10～15min，10%～90%，15～20 min，90～10%，检测波长254nm，流速1.0mL/min，柱温25℃[8]。

1.2.3.5 色素红外光谱（IR）比较

取1.2.1 项下红色、白色樱花的提取液，水浴蒸干，上X-5 大孔树脂柱（30 g），先以水洗至无色，再以80%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，干燥至恒重，以溴化钾压片，进行红外光谱测定。

1.2.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性

取0.45 μm 过滤膜提取液1 mL，60℃干燥至恒重，以50 mL二甲基亚砜(DMSO) 溶解。参考文献[9]测定α-葡萄糖苷酶活性，取500 μL磷酸盐缓冲液( 0.1mol/L，pH 值6. 8) 和50 μL 0.01776 mol/L 4 -硝基酚-α-D -呋喃葡萄糖苷(PNPG) 于10 mL刻度试管，加入50 μL 0.625 g/L的样品和50 μL0.10U/mL的α-葡萄糖苷酶，温浴20 min，用1.0 mol/L Na2CO3溶液100 μL 终止反应，将反应液于405 nm 波长下测定吸收度，并用蒸馏水代替酶液作空白。每个样品同一浓度下作3个平行，取其平均值。同时做相同体系下的样品空白组(A样品空白) ，不加样品的阴性对照组(A阴性) ，不加样品、酶与底物的空白对照组(A空白) 。按照酶活性抑制率=[1-(A样品-A样品空白)/(A阴性-A空白)]×100%，计算抑制率。

2 结果与分析

2.1 总黄酮、多糖含量及抑制α-葡萄糖苷酶活性

表1 显示，红色樱花中黄酮和多糖的含量较高，分别达到12 mg/g 和20 mg/g，其中红色樱花中黄酮含量高出白色樱花约50%。红色樱花中黄酮和多糖成分抑制α-葡萄糖苷酶活性较强，分别达到80.76%和70.16%，显示红色樱花可能在有效成分的开发应用上有一定资源优势。

表1 不同成分抑制α-葡萄糖苷酶活性（n=3）Table 1 Different compositions and inhibitory effect on α-glycosidase

2.2 色素成分比较

2.2.1 色素的提取

由表2 可知，以樱花本色为参考，确定乙酸乙酯-乙醇（1:1）提取红色樱花中花色素较好，以乙酸乙酯提取白花樱花中花色素较好。

表2 红色、白色樱花中色素成分的提取Table 2 Extracting method of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

2.2.2 色素显色反应

根据实验方法，测定色素显色反应，结果如表3所示。红色、白色樱花中色素均与盐酸-镁粉反应呈浅红，表明均有有黄酮类成分；氢氧化钠、碳酸钠、三氯化铝、乙酸镁反应，表明其均含有酚羟基基团；与三氯化铁、铁氰化钾-三氯化铁呈绿色，且较深，表明为酚类；与硼氢化钾反应呈橙红色，表明红色樱花色素中可能含少量二氢黄酮类，而白色樱花不反应。白色樱花色素与香草醛-盐酸反应呈粉红色，表明可能含有间苯二酚或间苯三酚结构[8-9]。因此，初步判断红色、白色樱花中色素主要成分可能分别为黄酮类、酚类。

表3 红色、白色樱花中色素成分的显色反应Table 3 Chromogenic reaction of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

2.2.3 色素UV 比较

经过紫外扫描，红色色素在423、370 nm 有最大吸收，且在200 nm 左右有较多杂峰，符合黄酮带Ⅰ300～400 nm，带Ⅱ220～280 nm 吸收特征[10]，提示可能含有黄酮成分。白色樱花中色素成分于426、370 nm 处也有明显吸收峰，符合黄酮带Ⅰ300～400 nm 吸收范围，但未见带Ⅱ240～280 nm吸收，提示可能是白色樱花中黄酮含量较低，导致吸收较弱。

2.2.4 色素HPLC 比较

根据HPLC 检测方法，测定了色素的可能组成，结果图1 所示。保留时间6.162 min（6.163 min）可能为白、红樱花色素相似或相同成分，且在两花中含量均较高，其成分类型有待进一步研究确定。而其他成分差异较大。

图1 红色、白色樱花中色素HPLC 分析Fig.1 HPLC analysis of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

2.2.5 色素IR 比较

由图2 可知，红色、白色樱花中色素于3370、3390 cm-1处均为强而宽的羟基伸缩振动吸收峰；1600、1450、812 cm-1为苯环骨架振动吸收带；1070、1080 cm-1均为芳香基团不饱和C-H 弯曲振动吸收峰，这充分显示两种色素类成分为芳香类化合物。红色、白色樱花中色素于1260、1270 cm-1处为芳香醚（Ar-O-C）基团伸缩振动吸收峰[11]。另外，红色樱花中色素于1000～1750 cm-1处显示更多的相关峰，且有1260 cm-1峰强度较强，有812cm-1峰，显示黄酮含量高，而白色樱花中色素在该区域相关峰较少，1270 cm-1峰强度弱，显示黄酮含量较低。

图2 红色、白色樱花中色素IR 分析光谱Fig.2 IR scanning spectrum of red and white flowers pigment of Cerasua serrulata

3 讨论

两种颜色樱花中化学成分对比研究表明，红色樱花中黄酮和多糖的含量较高，其中黄酮含量高出白色樱花50%，多糖含量高出白色樱花33%，说明红色樱花有一定资源优势。根据显色反应和UV、IR 光谱初步判断，红色、白色樱花中色素主要成分可能分别为黄酮类、多酚类。HPLC 谱图判断红色、白色樱花有相同或相似成分，国内报道也说明红色、白色梅花的花色色素含相同黄酮成分，红色花色源于花色素或花色苷[12]。另外，樱花中黄酮、多糖和色素成分的组成、结构、性质有待进一步鉴定，红色和白色之间变色机理有待进一步深入研究。

据报道，天然产物中多糖成分具有抗肿瘤[13]、免疫调节[13-14]、抗糖尿病[15]、抗凝血[16]、抗病毒[17]、抗氧化活性[18]及抑制α-葡萄糖苷酶作用[19]。黄酮成分具有抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的作用[20]。色素成分有抗氧化、抗肾结石作用[21]。酚类成分有抗氧化、抗菌作用[22]。另外，国内对于樱花中多种成分的研究和开发受到广泛关注，如樱花黄酮、多糖的抗氧化活性[4-5]，其黄酮可明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和降低冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性[23]。樱花红色素可作为食用色素用于食品行业，具有安全、无毒等特点[24]。樱花提取物可促进乳酸菌增殖，抑制酸奶的后酸化，提高酸奶的抗氧化活性[25]。国内已分离出多种抑制α-葡萄糖苷酶的黄酮成分，有学者从506157 菌株次级代谢产物中分离出的4'，7-二羟基异黄酮[26]，从链霉菌属菌中分离出的染料木黄酮[27]，从大豆分离出大豆异黄酮[28]，从印度鱼藤分离出的4’，5’，7-三羟基异戊二烯基异黄酮[29]。因此，樱花的研究和开发具有广阔的市场前景。