四川茂县花椒根腐病病原菌的分离与鉴定

李志克，唐 蓉，黄小琴，张 蕾，张重梅，鲜赟曦，何天伟，周西全，刘 勇，杨潇湘

（1四川省农业科学院植物保护研究所，农业农村部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都610066；2茂县林业和草原局，四川茂县623200；3营山县农业农村局，四川营山637700）

0 引言

花椒(Zanthoxylum bungeanum)属芸香科、花椒属多年生香料和油料树种，果实含有挥发性油和脂肪，可作食品香料和香精原料，果实还是调味佳品，并具有医疗作用，因此受到了广泛关注[1]。在中国四川、陕西、云南、甘肃、贵州、河北、湖北、湖南、安徽等省栽培面积较大，产量高[2]。四川省阿坝藏族羌族自治州茂县花椒栽培历史悠久，依托得天独厚的岷江干旱河谷气候条件，形成茂县大红袍花椒油重粒大、色泽红亮、芳香浓郁、醇麻可口的独特风味，在市场上享有较高声誉，已成为中国国家地理标志产品和茂县高半山老百姓脱贫奔康的重要农业支柱产业[4-5]。然而，花椒树在生长过程中极易受到病虫害的侵袭，加之近年来受市场因素的影响，茂县花椒栽培面积增加，一度陷入粗放管理和掠夺式生产阶段，茂县花椒病虫害发生日趋严重。其中，花椒根腐病在茂县发生尤为严重，新椒园发病率为20%左右，成年椒园病株率达35%以上，且为害程度逐年上升，椒农损失巨大。受害花椒根部变色腐烂，有异臭味，根皮与木质部脱离，木质部呈黑色。地上部分叶形小而色黄，枝条发育不全，造成大批椒树死亡，严重影响茂县花椒的产量和品质，甚至造成毁园[5-6]。此外，该病的顽固性土传特性，导致新栽植花椒易感菌死亡。老椒园不能继续栽植花椒是茂县花椒产业难以持续发展的一大难题[5]。研究花椒根腐病病原菌的归属种类，是科学有效防控该病害的首要条件。目前关于花椒根腐病病原鉴定的研究相对较少。1994年，朱天辉和陈第先通过病原分离和致病力测定，分离得到花椒根腐病的致病菌，并对病原菌分生孢子的形状、大小等形态特征进行观察测定，首次发现引起四川汉源花椒根腐病的病原菌为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)[7]。2006年，李智敏等人亦对云南省昭通市花椒根腐病的病原进行分离培养和形态学鉴定，结果表明云南花椒根腐病的致病菌为茄形镰刀菌(F.solani)，与朱天辉等记载的腐皮镰刀菌相一致[8]。以上关于花椒根腐病病原鉴定的研究皆是基于形态学观察的鉴定手段。然而，镰刀菌属是一个庞大的属，其种类繁多，且部分镰刀菌存在多个专化型，种间形态学特征较为接近，仅以形态特征对镰刀菌进行种类鉴定是不够准确的[9]。本研究通过茂县花椒根腐病病根采集、病原分离和纯化、致病力测定，并结合传统的形态学鉴定和基于核糖体转录间隔区序列(ITS)和延长因子基因序列(tef1)的分子鉴定，准确确定了茂县花椒根腐病病原的分类地位，旨在为科学有效防治茂县花椒根腐病提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 病原微生物的分离与纯化

花椒根腐病病根样品采自四川省阿坝州茂县沟口镇与叠溪镇花椒园，并记录症状和拍照。将花椒病根表面土壤清洗干净后，用刀片将其切成约5 mm×5 mm的病根组织，病原菌的分离方法采用组织分离法。进行分离培养。待菌落形成并产孢后采用孢子直接挑取法进行病原菌纯化得到单孢菌株。将单孢菌株转入PDA试管斜面培养基，置25℃光照培养箱进行培养，待斜面长满后置于4℃保存备用。

1.2 致病性测定

一年生花椒幼苗根系作切伤处理后栽种在灭菌营养土中。将浓度为1×107个/mL病菌孢子悬浮液灌注在花椒根部附近的土壤中，20～ 50天后观察病情，发病后再次通过组织分离法分离病原菌，若分离得到的病原物与原接种菌株一致，则确定该病原物为花椒根腐病致病菌，完成柯赫氏法则的验证[8]。

1.3 病原菌形态观察

将病原菌置于PDA平板培养基上进行活化，用直径为5 mm打孔器打取边缘菌丝，接种于PDA培养基上，置25℃光照培养箱进行培养，观察菌落形态、色泽及产孢情况等。在显微镜下观察孢子的类型、大小等特征。

1.4 病原菌的分子鉴定

利用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌的DNA，用引物ITS1/ITS4[10]和EF1/EF2[11]扩增根腐病菌的核糖体转录间隔区序列(ITS)和延长因子基因(tef1)。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。将测序得到的序列在NCBI进行BLAST序列比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，下载相似性高的序列，使用采用MEGA7软件分析生成系统发育树。

2 结果与分析

2.1 花椒根腐病病害症状

对茂县沟口镇与叠溪镇的花椒根腐病发生情况进行了调查，花椒根腐病在成年椒园中发生普遍，病株率达35%以上，其症状表现为根部变色腐烂，有异臭酸味，根皮易脱落，皮下木质部呈现黑色（图1A），地上部分的叶片小，叶片部分失绿。为害重时，造成整株植株死亡，极大的影响了茂县花椒的品质及产量。

2.2 病原菌的致病性测定

根据常规分离纯化法，得到菌落形态一致的分离物，并通过孢子直接挑取法获得单孢菌株2020M1。采用盆栽接种法接种菌株2020M1的孢子悬浮液，20天后有伤口的根系开始变黑；30天后花椒地上部分出现萎焉，根系表皮脱落、根部变黑腐烂，与椒园花椒根腐病发病症状相似；40天后在茎杆基部可见病原菌菌丝（图1B、C），人工接种的花椒根腐病发病率为100%。对照的花椒苗根部完好，无相应病害症状（图1D）。通过对接种发病的花椒病根进行病原分离，得到了与原接种病菌菌落形态一致的分离物，由此确定该分离菌株与原接种菌株一致，完成柯赫氏法则验证。

图1 花椒根腐病危害症状

2.3 病原菌形态观察

花椒根腐病致病菌株在PDA培养基上生长迅速，菌落呈圆形，菌丝初为灰白色，后为兰褐色或紫红色，表面稀疏。大型分生孢子镰刀形，0～ 3个隔膜，大小为(24.7～ 46.0)μm ×(4.5～ 7.4)μm；小型分生孢子呈肾形，0～ 1个隔膜，大小为(8.4～ 20.6)μm ×(3.2～ 6.5)μm（图 2）。通过病原菌形态学观察，确定该病原菌属于镰刀菌属(Fusarium)真菌。

图2 花椒根腐病病原菌形态特征

2.4 病原菌分子鉴定

利用ITS、tef1基因特异引物对分离得到的根腐病致病菌株进行PCR扩增，将测序获得序列与GenBank中相关数据进行相似性分析。选取不同种类镰刀菌的ITS和tef1序列，首位相连，采用MEGA 7软件分析生成多基因系统发育树。由系统发育图可知，茂县花椒根腐病病原分离物2020M1与腐皮镰孢菌(F.solani)W5-3、4100、FJAT-31354处于同一分支，亲缘关系最近（图3）。因此，联合花椒根腐病病原菌的菌落形态特征和分子鉴定结果，将引起茂县花椒根腐病的病原菌确定为腐皮镰孢菌(F.solani)。

图3 基于ITS和tef1序列构建的2020M1菌株系统发育进化树的病原菌种类进行

3 讨论与结论

本研究通过观察四川茂县花椒根腐病的危害症状和病原菌的形态学特征，初步确定引起茂县花椒根腐病的病原菌为镰刀菌属(Fusarium)真菌。为进一步明确病原，采用ITS、tef1基因特异引物对病原进行PCR扩增，并构建系统发育树。结果表明，引起茂县花椒根腐病的病原菌为腐皮镰孢菌(F.solani)。

镰刀菌属是分布十分广泛、非常庞大的一个属，不仅种类繁多、部分镰刀菌存在多个专化型，以及镰刀菌种间差异微小，加上镰刀菌属真菌在生长过程中形态变异较大，传统的花椒根腐病病原菌鉴定方法仅仅依靠病原菌分生孢子的形状、大小等形态特征，很难准确的区分种类[9,12-13]。而花椒根腐病传染性和致病性强且不易清除，准确确定其病原对该病的防控具有重大的意义。近年来，多基因分子鉴定的方法在镰刀菌种类鉴定上应用广泛，可以准确分类。目前应用于镰刀菌鉴定常用的基因位点主要有ITS、tef1、β-tubulin、28S rDNA等[14]。如唐贵婷等[15]基于ITS基因序列和tef1基因序列相结合确定引起重庆南苍术根腐病萎蔫病现象的病原菌是腐皮镰孢菌(F.solani)。曹瑱艳等[16]同样依据ITS基因序列和tef1基因序列相结合，确定厚垣镰刀菌(F.chlamydosporum)为浙江省金华市武义县铁皮石斛根腐病的主要致病菌。朱孟烽等[9]采用ITS、tef1、βtubulin和28S rDNA四个基因位点证实咖啡腐皮镰孢黑果病病原菌为(F.solani)。本研究采用形态学观察为辅助、结合ITS和tef1基因序列的分子鉴定，构建多基因系统发育树，最终准确确定引起茂县花椒根腐病的病原菌为腐皮镰孢菌(F.solani)。

花椒根腐病病原菌的分离与准确鉴定为该病害的防控提供了理论基础，但花椒根腐病的发生流行规律、病原菌的生物学特性和侵染循环等是开展监测预警及其有效防控的前提条件，还需进一步研究明确。此外，腐皮镰孢菌寄主范围广泛，除了造成多种植物的根腐病[15]、茎腐病[17-18]外，还可以侵染引起咖啡[9]、桃子[19]和香蕉[20]等的果腐病，造成芒果[21]、茶叶[22]、刺桐[23]等的叶斑和枯萎病。本研究鉴定的花椒根腐病病原菌株2020M1的寄主范围如何，是否也可侵染其他植物，造成根腐病、果腐病等病害？还得进一步研究，以便为病害的进一步防控和植物合理布局提供依据。

综上，本研究通过对采自四川茂县的花椒根腐病病根进行病原菌分离纯化、柯赫氏法则验证、形态学观察与基于ITS和tef1基因序列的分子鉴定相结合，构建多基因系统发育树，确定引起茂县花椒根腐病的病原菌为腐皮镰孢菌(F.solani)。