藻胆蛋白源生物活性肽研究进展

李富强，张廷新，李晓杰，朱丽萍，颜世敢

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室，济南250353）

0 引言

藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于微藻、蓝藻和一些真核藻类中的天然捕光色素蛋白。根据其所含的色基类型及其吸收光谱的不同，藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)和藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin，PEC)四大类[1]。藻胆蛋白呈水溶性，无毒，呈现鲜艳的色泽，能发射明亮的荧光，具有抗氧化、抗辐射、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、调节免疫和保护神经等多种生物学活性，可用作食品或化妆品的天然色素、抗氧化剂、光敏治疗剂、荧光检测试剂、免疫增强剂、肿瘤抑制剂、抗病毒药物等，应用前景广阔。

生物活性肽是对生物体具有抗氧化、降血压、降血脂、降胆固醇、免疫调节、抗菌、抗炎、抗癌和促进矿物质吸收等生理调节功能的多肽[2]。藻胆蛋白一级结构中的一些氨基酸序列，通常在蛋白质内部不起作用，但经水解后会被释放出来，对人体健康发挥有益作用。藻胆蛋白源生物活性肽是指藻胆蛋白经蛋白酶水解后得到小分子肽，一般由2～ 10个氨基酸残基组成，相对分子质量常低于3 kDa，具有比藻胆蛋白更高的生物学活性。

研究者很早就注意到藻胆蛋白酶解产物的活性。范敏[3]发现胰蛋白酶酶解藻蓝蛋白的产物对人宫颈癌HeLa细胞株生长具有抑制作用。马莹[4]利用胃蛋白酶和胰蛋白酶先后酶解藻胆蛋白，从酶解产物中获得分子量小于3 kDa、具有ACE抑制活性的组分。Martínez-Palma等[5]通过胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解藻胆蛋白得到具有抗氧化能力的酶解产物。早期的研究都未分离纯化出具有活性的多肽序列。因此，对藻胆蛋白源生物活性肽的结构、功能有待深入研究。

本文综述了藻胆蛋白源生物活性肽的类型、结构及功能，期望为藻胆蛋白源生物活性肽的研发、应用提供支撑。

1 藻胆蛋白源抗氧化肽

人体的衰老以及许多疾病（如关节炎、动脉硬化、冠心病、神经性疾病和癌症等）都与体内产生的自由基有关[6,7]。自由基可摧毁细胞膜，使细胞不能吸收营养物质，不利于代谢产物的排出，丧失对细菌和病毒的抵御力，导致免疫力低下、疲劳和器官病变等[8]。

食品变质是由于脂质的氧化或酸败，形成不需要的脂质过氧化物而引起的。

目前在食品和制药工业中，丁基羟基茴香醚(BHA)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙酯(PG)等人工合成抗氧化剂已被用于延缓氧化过程。由于潜在的健康问题，必须严格控制人工合成抗氧化剂的使用[9]。寻找安全、天然抗氧化剂替代人工合成抗氧化剂在食品工业中显得尤为重要[10]。

具有疏水性的氨基酸是良好的质子供体和金属离子螯合剂。酸性、碱性和芳香族氨基酸也有助于去除金属离子，特别是脯氨酸(Pro)对多肽清除自由基特别重要[11]。在抗氧化肽中，天冬酰胺(Asn)残基同样较为常见，例如：ILGATIDNSK[12]、EQEEEESTGRMK[13]、VNLTPCEKHIME和LTPCEKHIME[14]等。在藻红蛋白[15–18]和藻蓝蛋白[19–22]中含有较多疏水和芳香族的氨基酸残基，在体内、外的抗氧化测定中表现出显著的氧自由基清除能力。EUN-YOUNG KIM等[23]利用双向电泳和ESI-Q TOF MS/MS从条斑紫菜藻红蛋白中鉴定了13种多肽(PBP1-PBP13)，并在HepG2细胞模型上检测了13种多肽对活性氧生成的抑制作用。结果显示PBP2(RYVSYALLAGDPSVLEDRC)在浓度为0.1～ 1 μg/mL时可使活性氧(ROS)产量比阳性对照降低50%以上，显著降低了H2O2介导的HepG2细胞的氧化应激，PBP2通过上调p-Nrf2/SOD的表达来抑制ROS的产生。余颉等[24]用蛋白酶K消化螺旋藻，经过超滤、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离得到一种新的抗氧化肽，ESI-MS鉴定序列为PNN。在浓度为100 μg/mL时，其对DPPH的清除率为81.44%，与谷胱甘肽(82.63%)相近，超氧阴离子、羟自由基的清除能力和SOD活性均显示出良好的抗氧化能力。

2 藻胆蛋白源抗炎肽

炎症反应是指机体组织受损伤或异物入侵时发生的以防御为主的反应过程，严重的炎症反应可从局部的炎症病灶蔓延，引起败血症，最终导致死亡。临床应用的抗炎药物大多都有较严重的不良反应，如损伤机体组织器官和免疫抑制作用等。因此研发有效、毒副作用低的抗炎药物尤为重要。具有抗炎活性的多肽通常氨基酸序列中富含亮氨酸(Leu)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)和精氨酸(Arg)等疏水性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基，这些氨基酸残基对多肽的抗炎活性具有重要影响[25]。藻胆蛋白具有抗炎作用[26]。Daeyoung Lee等[27]利用嗜热蛋白酶(Thermolysin)消化掌状红皮藻的水提物得到酶解水提物(d-DWE)。在用脂多糖诱导的巨噬细胞炎症模型上，巨噬细胞中NO、TNF-α和IL-6的产生随d-DWE浓度的增加而显著降低，d-DWE抑制NO的最低作用浓度为100 μg/mL，对TNF-α和IL-6的抑制作用最低浓度为50 μg/mL。d-DWE浓度为250 μg/mL时对炎症介质分泌的抑制作用最强。然后以小鼠的足爪水肿增加率评价抗炎活性，饲喂d-DWE的小鼠的足爪水肿发生率均低于30%，说明d-DWE具有体内抗炎活性。经MALDITOF-MS鉴定，源自藻红蛋白的十肽(LRDGEIILRY)和脱镁叶绿酸具有抗炎活性。当十肽(LRDGEIILRY)的浓度为200 μg/mL时，RAW 264.7细胞中IL-6和TNF-α的分泌明显减少。这是藻胆蛋白源抗炎肽的首次报道。

3 藻胆蛋白源降压肽

高血压是引起心血管疾病的潜在危险因素，慢性肾功能衰竭、中风等疾病也是由持续性高血压引起的。肾素-血管紧张素调节系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)是人体血压的重要调节系统。血管紧张素转化酶(ACE)是这2个调节系统中的关键酶。ACE的抑制可以导致血管紧张素Ⅱ减少和血管扩张剂缓激肽增加，起到降血压的作用。目前ACE是降压药物的主要作用靶点[28]。ACE抑制肽序列在C-末端通常含有较多的疏水性氨基酸残基，N-末端含有支链脂肪族氨基酸残基，譬如STSFPPK[29]、LAHMIVAGA和VAHPVF[30]等。伍强等[31]用胃蛋白酶和胰蛋白酶先后消化红毛菜R-藻红蛋白，酶解产物ACE半数抑制浓度(IC50)为191.1±4.1 μg/mL，经Sephadex G-15凝胶层析和反相-高效液相色谱纯化得到2个ACE抑制肽：AILAGDPSVLEDR 和 VVGGTGPVDEWGIAGAR，IC50分别为57.2±5.0和66.2±4.2 μg/mL，两种多肽都不能被胃肠道中常见的蛋白酶破坏，故能够被胃肠道吸收而发挥其ACE抑制活性。Yumi Kitade等[32]在测定日本马泽藻的三种藻胆蛋白一级结构时发现日本马泽藻与其他红藻有较高的同源性，含有其他红藻中已鉴定的ACE抑制肽序列YRD、LDY、LRY、VY、LF和FY[33–35]。对日本马泽藻参照Furuta的方法[33]使用热裂解酶水解后，结合体外ACE抑制活性实验，验证了水解物具有较高的ACE抑制活性（约为63%），氨基酸序列分析显示其富含疏水氨基酸残基(46.0%～ 52.3%)，特别是芳香族（Y和F）或支链（V、L和I）侧链残基。

4 藻胆蛋白源降糖肽

糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷或其功能受损，或两者兼有引起的一种以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病可能导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害和功能障碍。目前糖尿病的治疗主要是刺激胰腺分泌胰岛素，减少肝脏输出葡萄糖，帮助肌肉细胞、脂肪细胞和肝脏从血液中吸收更多的葡萄糖等。用于治疗Ⅰ型糖尿病的药物主要是胰岛素。鉴于胰岛素不能直接口服及口服降糖药的毒副作用，寻找安全无毒副作用的药物受到广泛关注。具有降糖活性且无毒副作用的生物活性肽成为降糖药物的一个重要来源。

藻胆蛋白源多肽在不同动物模型中具有体内降血糖活性[36]。Li等[37]用胰蛋白酶消化钝顶螺旋藻藻胆蛋白，将酶解产物用二肽基肽酶-IV（DPP-Ⅳ酶）和Caco-2细胞模型进行体内外的降血糖活性表征，结果表明，PBP酶解产物在体外对DPP-Ⅳ酶活性有抑制作用，酶解产物浓度为2.5 mg/mL时，DPP-Ⅳ酶酶活降低了55.3%，且与剂量呈正相关，IC50值在0.5～ 1 mg/mL范围内。酶解产物经HPLC-Chip-ESI-MS/MS鉴定得到26种多肽，其中各有13条分别来自于C-藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。Maria Cermeno[38]用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶对紫菜中的藻胆蛋白进行酶解，测定酶解产物及各组分的氧自由基吸收能力、血管紧张素转换酶(ACE)和二肽基肽酶（DPP-Ⅳ酶）的抑制活性，利用半制备反相高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术对水解物进行分离鉴定，得到三种肽：DYYKR、YLVA和TYIA，其中YLVA具有最高的DPP-IV抑制活性(IC50=439±44µmol/L)，DYYKR 具有最高的 ORAC 活性（4.27±0.15 µmol Trolox当量/µmol/L），TYIA具有最高的ACE抑制活性(IC50=89.7±7.10µmol/L)。这是首次在紫菜的藻胆蛋白中获得具有降糖活性的藻胆蛋白肽。

5 藻胆蛋白源抗肿瘤肽

目前的抗肿瘤药物普遍存在效率低、选择性差、毒副作用大、易产生肿瘤细胞耐药性等问题[39]。寻找高效、毒副作用小、选择性强的抗肿瘤药物是抗肿瘤治疗的当务之急。食源性生物活性肽因是在胃肠道消化或食品加工过程中由蛋白降解而来，具有分子量小、易被人体吸收、毒副作用小、无免疫原性等优点，为癌症的预防和治疗提供了新思路，受到国内外研究人员的关注[40]。

藻胆蛋白已被证明能够抑制肝癌[41]、乳腺癌[42]、卵巢癌[43]、结肠癌[44]、非小细胞肺癌[45]和恶性黑色素瘤[46]等。藻蓝蛋白可通过细胞色素C诱导人慢性粒细胞白血病K562细胞调亡[47]。鉴于藻胆蛋白的抗肿瘤活性，寻找具有抗肿瘤活性的藻胆蛋白肽受到广泛关注。范晓丹等[48]从坛紫菜蛋白的胰蛋白酶水解物中分离到3条对人乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A549和结肠癌细胞HT-29具有抗增殖活性的活性肽：VPGTPKNLDSPR、MPAPSCALPRSVVPPR 和 VR，IC50为 191.61～ 316.95 μg/mL。其中VPGTPKNLDSPR和MPAPSCALPRSV VPPR对人肝癌细胞MCF-7和HepG-2有较好的抑制作用，IC50分别为200.97 μg/mL和276.85 μg/mL。VR在浓度为500 μg/mL时，对MCF-7和HepG-2细胞的抑制率分别为66.3%和64.1%。人工合成的VPGTPKNLDSPR能使MCF-7的细胞周期阻滞在G0/G1期，并诱导细胞凋亡。Mao[49]也在坛紫菜蛋白的木瓜蛋白酶水解物中分离鉴定出一种新的多肽QTDDNHSNVLWAGFSR，对HepG-2细胞的抑制率达61.36%，IC50为271.6 μg/mL。

6 藻胆蛋白源抗菌肽

抗生素的滥用使微生物产生抗药性，从而影响抗生素对人类和动物细菌感染的疗效。传统的抗生素是通过抑制细菌细胞壁或DNA的合成而发挥作用，而抗菌肽主要通过在细胞膜上打孔杀灭细菌。利用抗菌肽治疗细菌感染不会导致耐药菌株的产生，故有望开发成为新型多肽类抗生素。

藻胆蛋白具有广谱的抗菌活性[50–52]。螺旋藻藻蓝蛋白对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和嗜水气单胞菌等都具有抑制作用[52]。孙宜君等[53]利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解螺旋藻蛋白，酶解产物分别通过Sephadex G-25凝胶层析、RP-HPLC和Superdex 75 10/300层析柱纯化，用MALDI-TOF/TOF-MS和LTQ串联质谱鉴定出抗菌多肽KLVDASHIRLATGDVAV RA，对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为8 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC值）为16 mg/mL，在较高浓度时（8×MIC值）仍无溶血活性。进一步研究发现，该抗菌肽能够增加大肠杆菌细胞膜的通透性并使细胞内部钾离子泄漏，破坏细胞膜的完整性，当抗菌肽穿透已发生损伤的细胞膜屏障后，其与DNA和RNA结合，首先抑制RNA合成，进而抑制细菌DNA合成和复制，使大肠杆菌G1期细胞数目显著增加，通过多种因素导致细菌死亡。付云等[54]采用枯草芽孢杆菌发酵螺旋藻渣，发酵产物具有显著的抗金黄色葡萄球菌效果，对发酵产物使用Sephadex LH-20凝胶层析和RP-HPLC分离纯化，MALDI-TOF-MS鉴定得到抗菌多肽ATHDNCCLRQS，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.014 mg/mL，该抗菌肽可使金黄色葡萄球菌细胞内钾离子泄露导致细胞膜通透性增加，同时抑制菌体蛋白合成和竞争性结合DNA，从而抑制细菌生长繁殖，其抑菌效果比枯草芽孢杆菌自身代谢产物伊枯草菌素[55]和KLVDASHIRLATGDVAVRA更强。

7 藻胆蛋白源免疫调节肽

生物活性肽的免疫调节功能包括免疫增强、抗炎作用等。有的抑制LPS诱导的与B细胞活性相关的NFκB的核易位，抑制IL-1β和增强TNF-α的释放[56]。有的抑制T淋巴细胞的表面CD69的表达和IL-2的分泌，抑制T淋巴细胞中TNF-α和IFN-γ的分泌[57]。有的明显提高IL-2、IL-4和IL-6的产生[58]。

藻蓝蛋白可显著增加正常小鼠和免疫功能低下小鼠脾细胞中抗体形成细胞的数量和产生抗体的能力，以增强免疫细胞活性从而提高机体的免疫力[59,60]。杨磊[61]利用木瓜蛋白酶消化螺旋藻泥制备得到酶解多肽，在免疫功能低下小鼠模型上实验，选取免疫脏器重量测定、碳粒廓清实验、抗体生成细胞含量、血清溶血素含量作为检测指标，并以螺旋藻粉作对照，结果发现酶解产物不仅能显著提高正常小鼠的免疫功能，而且能显著提高免疫低下小鼠的脏器指数、廓清指数和吞噬指数、抗体生成细胞含量及血清溶血素含量(P<0.01)；而灌胃螺旋藻粉小鼠的各指标与正常或免疫低下小鼠的均无显著差异(P>0.05)。

表1 藻胆蛋白源生物活性肽的结构和功能汇总表

8 展望

藻胆蛋白是广泛存在于藻类细胞中的一大类安全、健康的食物蛋白，具有独特的分子结构和生物学活性，在医药和健康领域具有广阔的应用前景。目前已经从螺旋藻、红皮藻、红藻、紫菜和裙带菜等藻类的藻胆蛋白中获得多种生物活性肽。但藻胆蛋白源生物活性肽的研发也遭遇一些困难：（1）藻胆蛋白源活性肽的制备多依赖于传统的酶解法，存在一定的盲目性；（2）用于酶解的蛋白酶不能循环利用，既增加了研发成本，又可能影响后续的分离纯化。笔者提出，可以尝试利用酶固定化技术将蛋白酶固定，可以对藻胆蛋白连续水解，这样能够在一定程度上控制水解度和减少酶的浪费。随着生物信息学的发展以及对活性肽的构-效关系的深入研究，利用计算机辅助模拟蛋白消化过程，将蛋白质模拟酶切得到的氨基酸序列输入生物活性肽数据库进行比对，可以预测生物活性肽。頡宇等[62]基于BIOPEP数据库，借助计算机辅助和酶解法相结合，定向制备出柠条籽蛋白抗氧化肽，这为生物活性肽的发掘和鉴定提供了新策略。随着现代分离、鉴定技术与生物信息学的发展，生物信息学预测与实验相结合的研究方法势必推动藻胆蛋白源活性肽的研发和应用。相信在不久的将来，越来越多的新型藻胆蛋白源活性肽将会被不断发掘、鉴定。