泛素特异性蛋白酶44在肝细胞癌中的表达及预后价值

王随境，赖杰怡，张丽红，李孜孜，张新科，陈杰伟

（1.华南肿瘤学国家重点实验室//中山大学肿瘤防治中心病理科，广东广州510060；2.中山大学附属第五医院病理科，广东珠海519000）

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率排世界第6位，是全球第3大癌症致死原因［1］。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型，约占85%~90%［2］。尽管我国过去十来年中，HCC发病率和死亡率都有所下降［3］，但早期诊断困难、术后复发、转移率高导致肝癌患者普遍预后较差［4］。晚期HCC的5年存活率不足15%［5］。有效的预后指标能够对患者进行分组并指导相应治疗，改善临床预后，但目前尚缺乏敏感性及特异性较好的指标对HCC患者预后作出准确预测［6］。泛素特异性蛋白酶44（ubiquitin specific pro⁃tease 44，USP44）是去泛素化酶（DUBs）中USP家族成员之一，其基本功能是去除靶蛋白的泛素链来避免靶蛋白被26S蛋白酶体降解并以此影响信号转导［7］。USP44被认为是细胞周期进程、基因表达和DNA修复等细胞过程的重要调节因子［8］。在先前的研究中，USP44被发现是一种肿瘤抑制因子，通过去泛素化Cdc20-Mad2复合体来调控纺锤体组装检查点蛋白，防止有丝分裂后期过早的到来；以及调节中心体分离、定位和纺锤体几何形状，防止染色体错误分离，进而抑制肿瘤发生发展［9-11］。近年来，研究者陆续报道USP44表达水平在肺癌、胰腺癌、肾细胞癌等显著下调，表达水平的下降促进了癌细胞增殖和迁移，低表达USP44的患者预后较差［10，12-16］。然而目前USP44在HCC患者中的预后价值未见文献报道。本研究运用免疫组织化学方法检测HCC患者组织中的USP44蛋白表达水平，并通过统计学分析判断与预后的相关性，旨在探讨USP44对HCC患者预后的价值。

1 材料与方法

1.1 病例临床资料收集

收集2000年至2015年在中山大学肿瘤医院行肝癌切除术且经病理确诊的161例HCC石蜡标本及29例相应癌旁组织，构建组织芯片。HCC患者诊断分级参照WHO肿瘤分类标准第四版，临床分期依据美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟TNM（tumor-node-metastasis）分期系统（2010版）。病例纳入标准：①患者术前未接受过抗癌治疗；②具有完整的临床病理信息和随访资料，所有患者均随访至2021年3月；③本研究获得中山大学肿瘤医院伦理委员会批准免知情同意。

1.2 免疫组化染色

USP44蛋白的免疫组化染色应用标准Envision法。组织芯片切片4µm，60℃烤片2 h，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，PH 9.0的EDTA高压修复2.5 min，流水冷却后，3%H2O2浸泡10 min消除内源性过氧化物酶，蒸馏水漂洗，一抗USP44兔抗人多克隆抗体（Abcam，ab205032，美国，稀释浓度1：150）37℃孵育50 min，PBS漂洗2 min×5次，二抗（DA⁃KO，k5007，丹麦）37℃孵育30 min，PBS漂洗2 min×5次，DAB显色，流水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 荧光免疫组化染色

采用荧光免疫组化染色试剂盒（佰诺全景生物技术有限公司，0061000050，中国）进行荧光免疫组化染色。

同1.2进行常规脱蜡，抗原修复，滴加封闭液（0018001030），室温孵育10 min，一抗USP44（Ab⁃cam，ab205032，美国，稀释浓度1：150）室温孵育30 min，PBS漂洗后，鼠兔通用型HRP标记二抗（0013001015）室温孵育10 min，PBS漂洗，滴加PPD570荧光染料染色工作液（0008100050，信号放大反应液稀释100倍），室温孵育10 min，PBS洗净，EDTA9.0微波修复后使用DAPI工作液（0012100050）复染10 min，PBS洗脱后，浸泡蒸馏水2 min，烤干，用抗淬灭剂封片，橡胶水泥封固四周，室温风柜风干，激光显微镜观察定位。

1.4 免疫组化染色评分

USP44免疫组化染色评分根据阳性肿瘤细胞的百分比和染色强度来评分：1）阳性肿瘤细胞百分比用百分数（%）表示；2）染色强度用（-、1+、2+、3+）表示：“-”为0分，“1+”为100分，“2+”为200分，“3+”为300分；3）阳性肿瘤细胞百分比与强度的乘积就是样本的分数（0~300分）。结果由两位经验丰富的病理医师进行独立评估，如果结果不一致，则由第3位高级病理医师重新阅片评分。本研究使用ROC曲线确定USP44表达水平的截断值［17］。

1.5 统计学方法

所有数据使用SPSS 25.0软件进行统计学分析。运用ROC曲线分析得出USP44表达水平的截断值，Wilcoxon符号秩和检验分析肝细胞癌组织和相应癌旁组织的表达差异，χ2检验分析USP44蛋白高低表达与临床病理参数的相关性。无病生存期（DFS）定义为从肝癌切除术后到复发或死亡的时间；总生存期（OS）定义为肝癌切除术后到癌症相关死亡或最后一次随访的时间。用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验比较生存曲线，再用Cox比例风险模型进行HCC患者影响预后的多因素危险因素分析，P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理资料概述

161例HCC患者包括男性138名，女性23名；年龄21~81岁，平均年龄51岁；临床分期Ⅰ~Ⅱ期112例，Ⅲ~Ⅳ期49例；病理分级G1~G2级85例，G3~G4级76例；161例HCC患者详细临床病理资料见表1。

表1 USP44蛋白表达与肝细胞癌患者临床病理参数相关性分析Table 1 Correlation between USP44 protein expression and clinicopathological parameters in 161 patients with hepato⁃cellular carcinoma ［n（%）］

2.2 UPS44蛋白在HCC组织及癌旁组织中的表达情况

本研究发现USP44蛋白在HCC中表达以细胞浆为主，可见核浆表达两例（2/161）；免疫组化染色强度可见阴性（-）、弱阳性（+）、中等阳性（2+）和强阳性（3+；图1）；通过比较肝细胞癌组织与相应癌旁组织的USP44蛋白染色分数，发现USP44在肝癌组织中的表达低于相应癌旁组织（Z=-5.124，P＜0.001，图3I），表明USP44在HCC中低表达，提示USP44在肿瘤发生发展中发挥潜在作用。

图1 UPS44在肝细胞癌组织及癌旁组织中的表达情况Fig.1 Expression of USP44 protein in hepatocellular carcinoma and adjacent normal tissues

2.3 USP44蛋白荧光免疫组化染色情况

经免疫荧光组织化学染色表明，USP44在HCC组织中主要表达于细胞浆（图2）。

图2 USP44蛋白主要表达于细胞浆Fig.2 USP44 is primarily localized at the cytoplasm

2.4 USP44表达水平的截断值

运用ROC曲线分析方法选择最大敏感度和特异性的点确定为USP44免疫组化评分的截断值。本研究中，对每个临床病理特征的敏感性和特异性进行了绘图（图3），最终选择生存状态作为最佳状态变量，结果显示USP44蛋白表达评分的截断值是145（图3A，AUC=0.630，P=0.006）。因此，定义≥145分为USP44蛋白高表达组，＜145分为低表达组，161例HCC患者石蜡组织中60.9%（98/161）存在USP44蛋白高表达。

图3 ROC曲线分析确定肝癌中USP44表达水平截断值Fig.3 ROC curve analysis was employed to determine the cut-off value for USP44 expression in HCC

2.5 HCC患者的USP44蛋白表达情况与临床病理参数之间的关系

经卡方检验分析发现，HCC患者的USP44蛋白表达在临床分期中，Ⅰ+Ⅱ期的高表达的病例明显高于Ⅲ+Ⅳ期（χ2=14.44，P＜0.001），肿瘤单发的肝癌患者高表达USP44蛋白的例数明显高于多发患者（χ2=8.04，P=0.005）；USP44蛋白的高低表达在患者的不同年龄、性别、肿瘤最大直径、病理分级、有无HbsAg感染、肝硬化、坏死、脉管癌栓中的差异均无统计学意义（P＞0.05；表1）。

2.6 USP44蛋白表达及各临床病理参数对HCC患者总生存时间的影响

本研究对可能影响HCC患者生存时间的参数采用Kaplan-Meier法单因素分析发现：临床Ⅰ-Ⅱ期患者的平均生存期（168.0月）长于临床Ⅲ-Ⅳ期患者的平均生存期（62.5月，Log-rankχ2=11.35，P=0.001，图4A）；病理G1~G2级患者平均生存期（170.5月）长于G3~G4级患者的平均生存期（71.9月，Log-rankχ2=6.25，P=0.012，图4B）；肿瘤多发患者的平均生存期比单发患者短，差异有统计学意义（Log-rankχ2=11.79，P=0.001，图4C）；肿瘤最大直径≤5cm的患者相比＞5cm的患者，有着更好的生存期（Log-rankχ2=6.78，P=0.009，图4D）；此外，坏死（Log-rankχ2=7.15，P=0.008，表2）、脉管癌栓（Log-rankχ2=8.33，P=0.004，表2）及USP44蛋白表达（Log-rankχ2=20.77，P＜0.001，表2）与HCC患者总生存期显著相关，而且USP44高表达组相对于低表达组患者有更好的总生存率（Log-rankχ2=20.77，P＜0.001，图4E）和DFS（Log-rankχ2=20.42，P＜0.001，图4F）。USP44高表达组患者平均生存期为185.0个月，3年生存率为79.6%，5年生存率为62.2%，而USP44低表达组平均生存期仅为59.6个月，3年生存率为47.6%，5年生存率为28.6%（表3）。

表3 USP44蛋白表达对HCC患者三年和五年生存率的影响Table 3 The expression of USP44 for Three-year survival rate and Five-year survival rate

图4 不同预后因素对161例肝细胞癌患者生存时间的影响Fig.4 Different prognostic factors for survival outcome in 161 patients with HCC

表2 单变量分析USP44蛋白表达及临床病理参数在161例肝细胞癌患者预后的意义Table 2 Analysis of USP44 protein expression and clinicopathological parameters in the prognosisof 161 patients with hepatocellular carcinoma

为研究USP44蛋白表达对不同亚组HCC患者生存的影响，进一步分析了USP44在不同临床分期、病理分级患者中的表达情况，结果显示USP44蛋白表达是临床Ⅰ~Ⅱ期（Log-rankχ2=4.81，P=0.028，图5A），Ⅲ~Ⅳ期（Log-rankχ2=10.13，P=0.002，图5B）及病理分级G1-G2级（Log-rankχ2=20.73，P＜0.001，图5C）亚组患者的预后因素。

图5 不同临床分期和组织学分级的肝细胞癌患者中USP44表达的Kaplan-Meier生存分析Fig.5 Kaplan-Meier survival analysis of USP44 expression in subsets of HCC patients with different clinical stage and Histologic grade

2.7 肝细胞癌患者的独立预后因素分析

将有意义的临床参数引入多变量Cox回归分析，结果显示临床分期及USP44蛋白表达水平是HCC患者的独立预后因素（HR=1.750，95%CI（1.026，2.985），P=0.040；HR=0.363，95%CI（0.213，0.620 ），P＜0.001；表4）。

表4 多变量Cox回归分析鉴别HCC患者的预后因素Table 4 Multivariate cox regression analysis identify prognostic factors for HCC patients

3 讨论

USP44是一种具有ZnF-UBP结构域的去泛素化酶，具有保守的半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺/天冬氨酸残基［18］。据报道，USP44在许多细胞过程中发挥作用，如细胞增殖、免疫、调节细胞周期、炎症反应、细胞自噬、基因表达与抑制、DNA修复及肿瘤发生等［19-22］。然而，USP44在肝细胞癌中的临床病理学意义尚不清楚。

在本研究中，我们用免疫组化方法检测了161例肝细胞癌组织及部分相应癌旁组织中USP44蛋白的表达情况，并经过ROC曲线分析得出一个客观的截断值来区分USP44高低表达组。经Wilcox⁃on符号秩和检验分析发现USP44在HCC中低表达，提示USP44在肿瘤发生发展中发挥潜在作用。经卡方检验显示，USP44的表达情况与临床分期、肿瘤单灶及多灶性存在显著相关。单因素Kaplan-Meier分析表明，USP44蛋白的表达对HCC患者生存有显著影响，低表达USP44的HCC患者预后不良，进一步多变量Cox回归分析发现USP44是HCC患者的有效独立预后因素。本研究结果初步提示USP44在肝细胞癌中扮演着抑癌的角色。

有研究发现，USP44通过去泛素化Cdc20-Mad2复合体来调控纺锤体组装检查点蛋白防止有丝分裂后期过早的到来，以及调节中心体分离、定位和纺锤体几何形状防止染色体错误分离，进而抑制肿瘤进展［9-11］。Yang等［13］研究发现，USP44在胰腺癌患者中表达下调，且USP44表达情况与预后成正相关。Huang等［15］发现，USP44的过表达抑制了大肠癌细胞的增殖，同时促进了细胞的凋亡，提示USP44在大肠癌中是一种抑癌基因。Zhou等［16］发现，USP44通过抑制肾透明细胞癌中的JNK通路来抑制细胞增殖和迁移，USP44的表达与肿瘤分期、病理分级呈负相关，且高表达USP44的患者有着更长的生存期。以上研究提示USP44在肿瘤发生发展中起到抑癌基因的角色，这与我们的研究结果一致。然而，有研究人员提出USP44通过稳定肿瘤启动子securin促进胶质瘤的恶性程度［23］。乳腺癌中，USP44在肿瘤干细胞（CSC）亚群中上调，并通过诱导血管生成拟态形成而促进癌症的进展、侵袭和转移［24］。USP44通过EZH2蛋白稳定化促进前列腺癌细胞的肿瘤发生［25］。这些发现提示USP44的过度表达可能与某些肿瘤的进展有关；表明USP44作为去泛素化酶，可以通过稳定生物体中的不同蛋白底物来发挥功能，在肿瘤发生发展过程中具有两面性。

本研究中，经免疫组织化学分析及免疫荧光染色进一步的验证，发现USP44在肝细胞癌中多数表达于细胞浆，提示USP44可能在细胞信号通路过程在细胞浆中发挥抑癌作用。既往研究发现，在非小细胞肺癌中USP44通过去泛素化PTEN蛋白，抑制PI3K/AKT途径中信号传导，从而抑制癌细胞生长［12］；在结直肠癌中，USP44通过去泛素化胞浆支架蛋白Axin使Wnt/β-catenin途径失活，从而抑制大肠癌细胞的增殖，同时促进细胞凋亡［15］。而在胰腺癌FBP1-MAPK途径中，USP44通过去泛素化FBP1蛋白来抑制糖酵解，从而抑制癌细胞生长，并调节吉西他滨耐药性［13］。FBP1拮抗糖酵解过程是通过其胞浆催化活性来实现的［26］。而在肝细胞中FBP1缺失会导致代谢异常和脂肪变性，由此引起的非酒精性脂肪性肝病是导致HCC的重要诱因［26］。由此推测USP44是否也是通过去泛素化FBP1蛋白来抑制肝癌细胞生长，这是一个值得探索的问题。此外，有研究发现细胞质中USP44在DNA病毒感染后会被招募到干扰素基因刺激蛋白（MITA）处，并从MITA中去除K48连接的多泛素链，从而阻止MITA蛋白酶体介导的降解，对DNA病毒诱导的先天免疫应答起正向调节作用［21］；而慢性感染乙型肝炎病毒（HBV）是肝癌发生的重要危险因素。因此，我们推测USP44在肝细胞癌发生发展过程中起着调节细胞增殖和抗病毒的双重作用。有趣的是Kang等［27］发表的文章提示USP44可能是存在血清中，通过挖掘敏感性较高的方法在血液中检测USP44的表达，并通过高通量队列验证其为血清学的潜在的标记物，是一个值得进一步探讨的问题。本研究为单中心的研究，具有一定局限性，有待以后进行多中心研究，扩大样本量，并深入研究其在肝癌发生发展中的作用机制。

综上所述，USP44是HCC患者的独立预后危险因素，是肝细胞癌患者预后良好的生物标志物。USP44蛋白的表达可作为筛选预后良好的肝细胞癌患者的一种手段，我们的研究可能为USP44成为肝细胞癌治疗的潜在靶点提供证据。