马铃薯淀粉废水降解功能菌株的筛选及其降解条件优化*

惠治兵 毕江涛 李文兵 刘 鹏 孙 权

(1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学环境工程研究院，宁夏 银川 750021)

我国是世界上马铃薯淀粉产量最大的国家，年产量约占世界的85.9%，马铃薯淀粉废水具有高COD、高浊度、高泡沫且易产生恶臭的特点，未经处理的淀粉废水排放后对环境造成了较大的影响[1]，不仅引起水体微生物的大量繁衍，消耗水中的溶解氧导致水生生物缺氧死亡，而且其自然发酵易产生H2S、NH3、吲哚等气体污染物，会给生态环境造成较大压力[2-3]。国外较多企业都尝试用化学、物理的方法来处理马铃薯淀粉废水，但受设备投入及运行成本的制约，应用普及不太理想。研究显示1 t淀粉废水中，含有约2.37 kg糖、0.26 kg氮、0.83 kg含硫蛋白物质和1.16 kg胶类，其有效成分适宜微生物生长，因此，利用微生物处理马铃薯淀粉废水具有一定的应用前景[4-6]。AGORINYA[7]从马铃薯淀粉废水的活性污泥中分离得到具有COD降解功能的微生物，发现未经优化的单菌株对COD去除能力较弱，所以对高效功能菌株的筛选和其降解条件优化迫在眉睫。

本研究以宁夏某马铃薯淀粉加工厂的马铃薯淀粉废水为菌源，从中筛选目标菌株，并对COD的降解能力进行优化，以期为马铃薯淀粉废水的生物法处理提供菌种资源和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源

采样点位于宁夏某马铃薯淀粉加工厂，马铃薯淀粉生产能力为2万t/a，产生马铃薯淀粉废水约10万t/a，COD的初始值为22 987 mg/L，研究所需菌株筛选自该废水。

1.1.2 培养基

富集培养基：将1 L的马铃薯淀粉废水pH调节至7.0，添加酵母粉1 g/L，蛋白胨1 g/L，121 ℃灭菌20 min[8]53。

分离培养基：蛋白胨10 g/L，氯化钠l5 g/L，牛肉浸膏5 g/L，琼脂20 g/L，灭菌马铃薯淀粉废水1 L，pH为7.0。

溶菌肉汤(LB)液体培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化钠5 g/L，蒸馏水1 L，pH为7.0。

营养琼脂(NA)培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L，pH为7.0。

1.2 方 法

1.2.1 菌株富集

将取样废水以10.0%(体积分数，下同)的接种量接种于富集培养基中，在28 ℃、150 r/min条件下恒温振荡培养2 d，取10%富集物重新接种于新的富集培养基中继续培养2 d，重复3次获得富集菌群[8]53。

1.2.2 菌株的分离与纯化

从上述富集培养液中取1 mL于灭菌试管并加入9 mL无菌水稀释后，依次重复稀释制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍数的稀释液，均匀涂布在分离培养基平板上，将培养基置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h之后，挑选长势良好、形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化3～4次，于-20 ℃冰箱保存[9]。

1.2.3 功能菌株的复筛

取纯化好的菌株接种于LB液体培养基，在28 ℃、150 r/min的条件下培养3 d后，6 000 r/min离心10 min获得高密度菌体，并用无菌水将其调节为600 nm波长处的吸光值(OD600)为1的菌悬液，以2%的接种量接入供试水体中，pH为7.0，温度28 ℃、150 r/min的条件下振荡培养，每天上午10点测定水体中的COD，COD采用重铬酸钾法测定[10]，每个处理重复3次，同时设空白对照(CK)。

1.2.4 菌株形态学和生理生化鉴定

菌株形态学鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册》。生理生化测定项目主要包括甲基红实验、乙酰甲基甲醇(V-P)实验、氧化酶实验、淀粉水解实验、硫化氢产气实验、α-乳糖实验、明胶水解实验、葡萄糖氧化酶实验、柠檬酸盐实验和脲酶实验，以上测定均参照《常见细菌系统鉴定手册》进行。

1.2.5 分子生物学鉴定及系统发育关系

将纯化好的菌株接种于斜面，进行16S rDNA序列测定，正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，对菌株进行16S扩增。多聚酶链式反应(PCR)扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 90 s，32个循环；72 ℃ 延伸10 min[11]。菌株测定序列提交NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov)GenBank数据库，登录号为MT105951。通过NCBI在线BLAST系统与数据库中16S rDNA序列进行比对，然后选取与目标菌株同源性较强的菌株序列，通过MEGA7.0构建系统发育树[12]。

1.2.6 菌株生长曲线的绘制

将保存的斜面菌接种于LB液体培养基中，在28 ℃、150 r/min的条件下活化培养，活化后将菌液以6 000 r/min离心，将菌体用无菌水稀释至OD600为1的种子液，取菌株种子液，按5.0%接种量转接至盛有灭菌后的LB液体培养基的三角烧瓶内，混合均匀后分别取5 mL混合液接入已标记好培养时间的20支试管(直径15 mm、高度150 mm)中，硅胶塞封口，设置3次重复，以不加菌的LB液体培养基作为空白。将已接种的试管于28 ℃、150 r/min的条件下进行培养，按标记的培养时间取出试管，测定其OD600，以空白作参比。以测得3次重复的OD600平均值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线[13]。

1.2.7 菌株发酵单因素条件优化

(1) pH对COD的降解影响：温度为28 ℃，接种量为2.0%，于150 r/min的条件下恒温水浴振荡培养3 d，分别测定3 d内pH在6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下马铃薯淀粉废水COD的降解情况，以确定最佳发酵pH，每组3个重复，下同。

(2) 温度对COD的降解影响：pH为7.0，接种量为2.0%时，其他条件不变的情况下，分别测定在15、20、25、30、35 ℃水平下的COD去除效果，以确定最佳发酵温度。

(3) 接种量对COD的降解影响：pH为7.0，温度为28 ℃时，其他条件不变的情况下，分别测定接种量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%水平下的COD降解情况，以确定最佳接种量[14]。

1.2.8 发酵条件响应面优化

在单因素实验结果基础上，采用3因素3水平的Box-Behnken响应面实验设计法，以pH、时间和接种量为自变量，以COD为响应值进行优化。采用Design-Expert 8.0软件对实验数据进行分析[15]，Box-Benhnken实验因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素与水平

2 结果与分析

2.1 功能菌株的筛选

从马铃薯淀粉废水中经富集、分离、纯化和筛选后共得到3株具有降解COD功能的菌株，编号分别为PWF015、PWF016、PWF017。3株供试菌株对淀粉废水COD的降解结果见表2，经3菌株分别处理3 d后，不同处理下的马铃薯淀粉废水的COD降解率与CK相比存在显著差异(P<0.05)。处理第1天，菌株PWF015的COD降解能力与CK相比差异最为显著，菌株PWF017次之，而菌株PWF016差异不显著。综合3 d的结果可以得出：菌株PWF015对马铃薯淀粉废水中的COD降解效果最显著(P<0.05)，其COD降解率为60.38%，说明在相同发酵条件下，菌株PWF015对淀粉废水的COD降解能力要强于另外两株菌，因此后续分析均以此菌株为基础。

表2 不同菌株处理间效果比较1)

注:1)不同小写字母代表差异显著(P<0.05)，图5至图7同。

2.2 菌株形态学和生理生化鉴定结果

选取菌株PWF015于NA培养基上培养12 h，然后选取有明显单菌落的培养基进行菌株形态观察。由图1可以看出，菌落隆起，呈圆形，表面褶皱粗糙，呈白色。菌株革兰氏染色结果为阳性，呈杆状(见图2)。菌株PWF015生理生化鉴定结果见表3，可以看出菌株具有降解淀粉、α-乳糖和葡萄糖等功能，对照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定该菌属于芽孢杆菌属(BacillusCohn)。

图1 菌株PWF015菌落图Fig.1 Colony diagram of strain PWF015

图2 菌株PWF015革兰氏染色镜检图Fig.2 Gram staining microscopy of strain PWF015

表3 菌株PWF015的生理生化特征1)

2.3 分子生物学鉴定及系统发育关系结果

测序序列与GenBank数据库比对，确定该菌为芽孢杆菌属。选取与目标菌株相似性较高的9株菌构建系统发育树，结果见图3，由系统发育树可以看出：菌株PWF015与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KU161297.1在同一分支，说明该菌与解淀粉芽孢杆菌亲缘关系最近，因此可以判断该菌为解淀粉芽孢杆菌[16]。

图3 菌株PWF015的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain PWF015

2.4 菌株生长曲线

按标记的培养时间依次从冰箱取出试管，测量菌液的OD600，结果见图4。在0～48 h，OD600呈上升趋势，在48 h出现峰值，而在48 h之后逐渐稳定并开始呈下降趋势，说明菌株在0～48 h处于生长繁殖期且生长较快，而在48 h达生长高峰期，之后逐渐进入衰退期。

图4 菌株PWF015的生长曲线Fig.4 Growth curve of strain PWF015

2.5 菌株发酵条件单因素实验

pH对COD降解的影响见图5。当pH为8.0时，菌株对COD的降解效果最好(P<0.05)，且优于其他处理，COD降解率为64.27%，由此可以看出，碱性条件有利于菌株对COD的降解。

图5 不同pH处理下菌株对COD的降解 Fig.5 Degradation of COD by strain under different pH treatment

温度对COD降解的影响见图6。随着温度上升菌株对COD降解能力提升较显著(P<0.05)，菌株的活性逐渐增强，对COD的降解效果随之提升，当温度上升为30 ℃时,COD降解率为65.89%，达到最高且差异显著(P<0.05)，而温度上升至35 ℃却对菌株的降解能力产生了抑制效果。

图6 不同温度处理下菌株对COD的降解Fig.6 Degradation of COD by strain under different temperature treatment

接种量对COD降解的影响见图7。接种量为1.5%时，菌株对废水COD降解能力最好(P<0.05)，COD降解率为55.92%，达到最高，接种量对菌株的降解能力有一定影响，菌株过多反而会起到抑制作用。综上所述，当pH为8.0，接种量为1.5%，温度为30 ℃时菌株对马铃薯淀粉废水的COD降解效果最佳。

图7 不同接种量下菌株对COD的降解Fig.7 Degradation of COD by strain under different dosage treatment

2.6 菌株发酵条件响应面优化

2.6.1 Box-Benhnken实验设计及结果

为了进一步优化菌株PWF015对COD降解的条件，根据单因素实验结果，选取pH、温度和接种量作为影响因素，以马铃薯淀粉废水COD降解率作为响应值进行Box-Benhnken实验。实验设计及结果见表4。

表4 Box-Benhnken实验设计及结果

2.6.2 二次回归方程拟合与方差分析

对实验数据进行二次回归方程拟合，得到COD降解率(Y，%)与pH(A)、温度(B，℃)和接种量(C，%)的二次回归方程为：

Y=71.54+0.99A-0.49B-0.72C+0.12AB+1.05AC-0.05BC-3.21A2-6.41B2-2.78C2

(1)

COD降解率的F值为12.82，P<0.01，表明效应极显著，R2=0.943 3，说明方程能够解释94.33%的COD降解率变化；变异系数<10%，表明实验的可信度和精确度高[17]。

2.6.3 两因素交互作用对COD的影响

由响应面分析结果可知：随着pH和温度的上升，COD降解率出现先升高后降低的趋势，当pH为8.0，温度为30 ℃时，响应面图存在峰值，废水COD的降解率为71.65%。当pH为8.0，接种量为2.0%时响应面图存在峰值，即COD降解率达到最大。温度为30 ℃，接种量为2.0%时废水COD降解率达到最大。分析可知，pH/温度和温度/接种量对COD降解率影响的交互作用较为显著，而pH/接种量的交互作用不显著。结合等高线和响应面可以得出：温度和pH对菌株降解COD的能力影响较大，接种量次之。

2.6.4 最优预测响应结果

如表5所示，当pH为8.07，温度为29.81 ℃，接种量为1.95%时达到最大理论优化值，COD降解率为71.65%，实验优化效果较显著。优化前COD降解率为60.38%，这与刘清兵[18]在虾养殖废水中分离得到COD降解率为55%的解淀粉芽孢杆菌相比，降解能力有些许优势，但实际应用中略有不足，原因可能是发酵条件对解淀粉芽孢杆菌产生α-淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶的能力和其产生酶的活性影响较大[19]，也可能是本实验所用马铃薯淀粉废水COD过高，加上其成分复杂，菌株的降解能力未能全部发挥出来，需进一步优化。

表5 响应面最优预测值

经响应面优化后，菌株对COD的降解率达到71.65%，较优化前提高了11.27百分点，总体来看，本实验所筛的菌株和发酵条件优化所用的响应面法，对解决马铃薯淀粉废水问题提供了一定帮助，说明了本实验研究成果的可取性。

2.6.5 响应结果验证

以响应面优化所得的理论条件进行验证实验，设3次重复，发酵后所得COD平均降解率为71.46%，与模型预测值仅相差0.19百分点，说明响应面法提供的模型较真实地拟合了实际情况，因此可以得出菌株PWF015在处理马铃薯淀粉废水时的最佳发酵条件是pH为8.07，温度为29.81 ℃，接种量为1.95%。因马铃薯淀粉废水含有大量的糖类、蛋白质、纤维素等有机营养物质[20]，为制作微生物菌剂和微生物肥料提供了良好的载体，而本实验分离的解淀粉芽孢杆菌具有较强的COD降解能力，可以作为菌种资源，为后续的菌株复配实验和相关产品研发打下了一定基础。

3 结 论

(1) 从马铃薯淀粉加工废水中筛选并分离得到一株具有COD降解效果的菌株，通过对该菌株形态学观察、生理生化实验和16S rDNA基因鉴定，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。

(2) 经单因素实验优化后，结果表明当pH为8.0，温度为30 ℃，接种量为1.5%时菌株对马铃薯淀粉废水的COD降解效果最佳。响应面优化结果表明pH、温度、接种量分别为8.07、29.81 ℃、1.95%时，COD降解率达到了71.65%，较优化前提高了11.27百分点。