冬季发热门诊患者咽拭子13项呼吸道病原体分析*

赵一琳，许晔琼，陈洁，俞建峰，宛传丹

(常熟市医学检验所分子生物学实验室，江苏常熟 215500)

以发热、咳嗽、呼吸急促等呼吸系统症状为主要临床特征的急性呼吸道感染(acute respiratory infection, ARI)，一直威胁着人类健康。新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情发生之初，我国即采取强有力的封闭隔离措施，通过强化个人防护、加强人口流动管理、大力提升核酸检测能力等一系列策略，及时切断病毒传播途径[1]。目前，因新型冠状病毒(SARS-CoV-2)变异，境外部分地区COVID-19疫情严重。国内采取严格的“内防反弹，外防输入”的策略，虽存在较少散发病例，但不会形成大规模流行感染之势。各级医疗卫生机构重点管控好发热门诊就诊患者，及时发现散发病例有利于从源头控制住病毒传播。本研究针对疫情常态化防控背景下冬季发热门诊疑似COVID-19患者咽拭子中可能存在的13种常见呼吸道病原体进行核酸检测分析，以研究COVID-19疫情防控形势下其他常见病原体的存在与分布特征。

1 材料与方法

1.1一般资料 收集2020年12月至2021年3月根据疫情防控要求，因发热症状而分诊至常熟市第一人民医院、常熟市第二人民医院与常熟市中医院发热门诊的患者368例，其中成年组(≥18岁)291例，年龄(37.8±5.9)岁；未成年组(<18岁)77例，年龄(12.3±3.5)岁。按照SARS-CoV-2采集要求进行咽拭子的采集、保存与送检。所有标本先经SARS-CoV-2核酸检测(RT-PCR法)。呼吸道感染疾病诊断标准参考《内科学》第3版相关标准[2]。

1.2仪器与试剂 SARS-CoV-2核酸快速提取试剂盒(磁珠法)(批号：20201121)、新型冠状病毒核酸扩增检测试剂盒(货号：JC102233-1N)、SAW-96全自动核酸提取仪(江苏硕世公司)。13种呼吸道病原体多重RT-PCR检测试剂盒(宁波海尔施公司)，微量分光度计Onedrop(美国热电公司)，普通PCR仪(13项病原体多重RT-PCR用)、QuantStudio5实时荧光定量PCR仪(SARS-CoV-2核酸检测用)、3500 Dx基因测序仪(美国ABI公司)。

1.3多重RT-PCR毛细管电泳法 用13种呼吸道病原体检测试剂盒检测甲型流感病毒(influenza A virus, InfA)、腺病毒(human adenovirus,HADV)、博卡病毒(bocavirus,Boca)、鼻病毒(human rhinovirus,HRV)、甲型H1N1流感病毒、副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)、衣原体(chlamydia, Ch)、偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)、乙型流感病毒(influenza B virus, InfB)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae, Mp)、甲型H3N2流感病毒(influenza A virus H3N2)、冠状病毒(human coronavirus, HCoV)、呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)。将临床咽拭子标本、阴性对照和阳性对照(厂家试剂盒中提供)充分混匀，各吸取200 μL，加入核酸快提深孔板(预分装试剂)，上全自动核酸提取仪按标准提取方案进行核酸萃取。用微量分光光度计进行核酸纯度验证。取5 μL核酸提取物作为扩增模板，加入预配的15 μL混合反应体系中。多重RT-PCR反应参数为：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，95 ℃ 2 min。第一次循环：94 ℃ 30 s，65～60 ℃ 30 s(每次循环递减1 ℃)，72 ℃ 60 s，共6个循环。第二次循环：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共29个循环。最后72 ℃ 10 min，4 ℃保存备用。吸取1 μL产物加至电泳上样液，与标准品(荧光标记DNA片段，厂家试剂盒提供)配成混合液9 μL，在ABI 3500 Dx上导入设置好的参数文件，毛细管电泳55 min检测分析。结果判读标准[3]：扩增产物中目的位点峰高度低于该道毛细管标准品低峰(NegS)的，判该位点阴性；扩增产物中目的位点峰高度高于该道毛细管标准品高峰(PosS)的，判该位点阳性；扩增产物中目的位点峰高度高于该道毛细管标准品低峰但低于标准品高峰的，判该位点灰区，重新进行核酸提取、扩增并电泳分析。若该位点若仍落在灰区的，判阳性；若落在阳性区域的，判阳性；若落在阴性区域的，判阴性。

1.4统计学分析 采用GraphPad 8.0作图，SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。率的比较用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1SARS-CoV-2核酸检测 经双重荧光RT-PCR检测，所有标本均未检出SARS-CoV-2病毒ORF1ab/N靶基因(检出限350 copies/mL)。

2.213种呼吸道病原检出率 未成年组77例中，检出阳性67例，检出率为87.0%，其中检出率排前五位为InfB、HRV、InfA、HRSV与Mp，HCoV与Ch未检出。成年组291例中，检出阳性116例，检出率为39.8%，其中检出率前五位为InfA、HRV、H3N2、InfB与HMPV；未发现HCoV、Boca和甲型H1N1流感病毒。未成年组检出率高于成年组，差异有统计学意义(χ2=108.366，P=0.000)。见表1。

表1 2020—2021年冬季发热门诊13种呼吸道病原体检出情况[n(%)]

2.3混合感染情况 183例阳性病例中，有34例混合感染(检出2种及以上病原体)，阳性病例中混合感染率占18.6%。其中，2种病原体混合感染28例，3种病原体感染3例，4种病原体感染3例。见图1。

注：InfA，甲型流感病毒；HADV，腺病毒；Boca，博卡病毒；HRV，鼻病毒；HPIV，副流感病毒；HMPV，偏肺病毒；InfB，乙型流感病毒；Mp，肺炎支原体；H3N2，甲型H3N2流感病毒；HRSV，呼吸道合胞病毒。

3 讨论

本文针对COVID-19疫情防控常态化背景下病毒感染流行季节中发热门诊其他常见13种呼吸道病原体的感染流行分布情况进行调查研究。结果显示，未检出SARS-CoV-2患者仍存在其他病原体感染。13种呼吸道病原体在未成年人组检出率87.0%，成年人组中为39.8%。从类型分析，冬季呼吸道感染流行主要的病原体为流感病毒。各年龄群中InfA、InfB检出率均居前位，与报道基本相一致[4-5]。未成年组中，HRV、RSV、Mp检出率较高，成年组中H3N2与HMPV检出较高。不同人群机体免疫力不同，生活环境与方式存在差异，即使在同一地区其感染的病原体也存在差异。根本原因在于冬季区域环境中流行的病原体存在方式不同，各研究报道的呼吸道病毒检出率均存在显著差异[6-7]。2020—2021年COVID-19疫情常态化防控背景下，对病毒感染流行有较大程度的影响。隔离阻断、改变社交方式等预防措施能有效降低呼吸道感染病原体的传播。未成年组检出率仍较高，可能是由于未成年人机体免疫尚在建立，学习活动聚集性高，预防意识较差等因素造成。因此，未成年人群仍将是冬季流感病毒主要受众人群。

混合感染现象较为普遍，检出率在18.6%，与上海、连云港近年检出的混合感染率基本一致[4-5]。混合感染多为2种病原体感染，其中InfA/InfB混合感染现象最为严重。混合感染多发生在未成年组中，与聚集性学习生活方式可能相关。临床要注意区分病原体种类，对其造成的感染疾病采取相应的治疗方案。3种以上病原体混合感染较少，混合感染的机制与临床意义有待探讨。

COVID-19疫情的发生大大推动了核酸检测在病原学诊断中的普及，而技术的自动化发展更促进了核酸检验高效、快捷、低廉的市场优势。病原学核酸检测将成为病原学诊断重要的直接证据。