耐碳青霉烯类抗菌药物革兰阴性杆菌临床分布及耐药基因调查*

邹凤梅，吴玲，李可可，刘刚，魏勤，李军春，王欣，杨永清，王晓宁

(甘肃省人民医院检验中心，兰州 730000)

革兰阴性杆菌是医院内感染常见的病原菌，也是临床标本中分离率较高的细菌之一。碳青霉烯类抗菌药物是一类抗菌谱广、抗菌活性强的β-内酰胺类抗菌药物，是临床治疗多重耐药革兰阴性杆菌的首选药物。近年来，随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，甚至不合理使用或滥用，耐碳青霉烯类抗菌药物的革兰阴性杆菌(carbapenem resistant organism, CRO)逐年增多，给抗感染治疗和院内感染控制带来极大的挑战。细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制有：外膜孔蛋白减少或丢失伴高水平β-内酰胺酶的持续产生、碳青霉烯酶的产生、药物作用靶位的改变以及青霉素结合蛋白的改变。碳青霉烯酶按照Ambler分子分类方法，碳青霉烯酶可分为A、B和D三类。A类为丝氨酸碳青霉烯酶，以KPC型为主；B类为金属β-内酰胺酶，以 NDM、IMP和VIM型为主；D类为OXA-48型丝氨酸碳青霉烯酶[1]。本研究收集2018—2020年临床标本中分离的60株CRO，对其临床分布、耐药机制以及检测方法进行调查，为CRO抗感染治疗合理选药以及院内感染控制提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2018年7月—2020年12月临床送检标本中对亚胺培南、美罗培南或厄他培南任一或均耐药的CRO菌株60株，剔除重复菌株。其中，肺炎克雷伯菌20株、阴沟肠杆菌13株、大肠埃希菌11株、雷极普罗威登菌5株、弗劳地枸橼酸杆菌2株和铜绿假单胞菌9株。质控菌株为ATCC 25922大肠埃希菌和ATCC 27853铜绿假单胞菌，购自卫生部临床检验中心。

1.2仪器与试剂 飞行质谱仪(布鲁克公司)，PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏系统(BD公司)，GeneXpert全自动荧光定量PCR检测仪(美国赛沛公司)；亚胺培南、美罗培南和厄他培南等药敏纸片(英国Oxoid公司)；血琼脂平板、M-H平板(郑州安图生物公司)；头孢他啶/阿维巴坦药敏纸片、3-氨基苯硼酸(APB)和EDTA试剂(上海抗生素研究所馈赠)；碳青霉烯酶耐药基因检测(实时荧光PCR法)试剂盒(美国赛沛公司)。

1.3细菌鉴定及药敏试验 用飞行质谱仪进行细菌鉴定。60株CRO菌株中，2株用K-B纸片扩散法、58株用PhoenixTM-100革兰阴性杆菌药敏板进行药敏试验。参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2020年版文件判断结果[2]，用仪器专家系统进行结果判定和分析修正。

1.4碳青霉烯酶表型筛选

1.4.1改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)联合EDTA改良碳青霉烯灭活试验(eCIM) CLSI推荐mCIM联合eCIM用于肠杆菌目细菌和铜绿假单胞菌中碳青霉烯酶的检测。mCIM和eCIM试验按照2020年CLSI M100文件要求进行操作。

1.4.2碳青霉烯酶抑制剂增强试验 碳青霉烯酶抑制剂增强试验是根据A类丝氨酸碳青霉烯酶的活性可被3-氨基苯硼酸(APB)抑制[3]，而金属β-内酰胺酶的活性可被EDTA抑制的特点[4-5]，APB联合EDTA可对单产A类丝氨酸碳青霉烯酶、单产B类金属β-内酰胺酶以及同时产生A类丝氨酸碳青霉烯酶和B类金属β-内酰胺酶的肠杆菌目细菌进行检测并区分[6]。实验步骤：将待测菌调制成0.5麦氏浊度单位的菌悬液，均匀涂布于M-H琼脂平板上，随后贴4张亚胺培南纸片于琼脂表面。1张纸片不加任何液体，1张纸片滴加APB溶液(浓度为30 mg/L)10 μL，1张纸片滴加EDTA溶液(浓度0.1 mol/L)10 μL，最后1张同时滴加APB溶液和EDTA溶液。过夜温育后量取纸片抑菌圈直径。结果判读如下：(1)添加APB溶液的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5 mm，即可判断该受试菌株产A类碳青霉烯酶；(2)添加EDTA溶液的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5 mm，即可判断该受试菌株产生B类金属β-内酰胺酶；(3)如仅同时添加APB和EDTA的亚胺培南纸片抑菌圈直径与单药纸片相差≥5 mm，可判断该受试菌株同时产A类碳青霉烯酶和B类金属β-内酰胺酶。

1.5实时荧光PCR法检测碳青霉烯酶基因型 用GeneXpert全自动荧光定量PCR检测仪，按照碳青霉烯酶耐药基因检测试剂盒说明书检测5种基因型(KPC、IMP1、NDM、VIM和OXA-48)。

1.6统计学分析 采用WHONET 5.6软件。

2 结果

2.1菌种分布 60株CRO菌株包括碳青霉烯类耐药的肠杆菌目细菌(CRE)51株(85.0%)和铜绿假单胞菌9株(15.0%)。其中，CRE包括肺炎克雷伯菌20株(39.22%)、阴沟肠杆菌13株(25.49%)、大肠埃希菌11株(21.57%)、雷极普罗威登菌5株(9.80%)、弗劳地枸橼酸杆菌2株(3.92%)。

2.2科室分布 60株CRO菌株中，59株(98.33%)分离自住院患者，1株(1.67%)分离自骨科门诊患者。住院患者分离菌株来自ICU 20株(33.33%)、神经外科9株(15.00%)、泌尿科9株(15.00%)、烧伤科8株(13.33%)、普外科4株(6.67%)、脑血管外科3株(5.00%)、骨科2株(3.33%)和其他科室3株(5.00%)。

2.3标本来源 60株CRO菌株分离自痰液20株(33.33%)、尿液14株(23.33%)、伤口分泌物11株(18.33%)、血液7株(11.67%)、穿刺液3株(5.00%)、静脉导管2株(3.33%)和引流液2株(3.33%)。

2.4碳青霉烯酶表型筛选结果

2.4.1mCIM联合eCIM检测结果 产丝氨酸碳青霉烯酶17株(肺炎克雷伯菌16株、弗劳地枸橼酸杆菌1株)，产金属β-内酰胺酶39株(阴沟肠杆菌12株、大肠埃希菌11株、雷极普罗威登菌5株、铜绿假单胞菌6株、肺炎克雷伯菌4株和弗劳地枸橼酸杆菌1株)，4株(铜绿假单胞菌3株和阴沟肠杆菌1株)为阴性。

2.4.2碳青霉烯酶抑制剂增强试验结果 产A类丝氨酸碳青霉烯酶17株(肺炎克雷伯菌16株、弗劳地枸橼酸杆菌1株)；产B类金属β-内酰胺酶38株(阴沟肠杆菌12株、大肠埃希菌11株、雷极普罗威登菌5株、铜绿假单胞菌6株和肺炎克雷伯菌4株)；混合型(产A+B类酶)1株(弗劳地枸橼酸杆菌)；4株(铜绿假单胞菌3株和阴沟肠杆菌1株)为阴性。

2.5碳青霉烯酶基因型检测结果 NDM型32株(阴沟肠杆菌12株、大肠埃希菌11株、雷极普罗威登菌5株、肺炎克雷伯菌4株)；KPC型17株(肺炎克雷伯菌16株、弗劳地枸橼酸杆菌1株)；IMP1型6株，均为铜绿假单胞菌；KPC+NDM混合型1株，为弗劳地枸橼酸杆菌；4株(铜绿假单胞菌3株和阴沟肠杆菌1株)未检出碳青霉烯酶。肺炎克雷伯菌以产A类丝氨酸碳青霉烯酶，携带KPC型基因为主，占80%(16/20)；产B类金属酶,携带NDM基因占20%(4/20)；阴沟肠杆菌、大肠埃希菌和雷极普罗威登菌均为产B类金属β-内酰胺酶,携带NDM基因为主，占92.31%(12/13)和100%(11/11，5/5)。

2.6表型筛选和GeneXpert荧光PCR方法结果的比较 碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测结果与PCR方法的检测结果完全相符，阳性和阴性的符合率均为100%。mCIM联合eCIM检测结果与碳青霉烯酶抑制剂增强试验、PCR方法的阴性符合率为100%，仅将1株产2种碳青霉烯酶的弗劳地枸橼酸杆菌检测为单产金属酶。

2.7抗菌药物耐药性 CRO菌株对临床常用抗菌药物中青霉素类、头孢菌素类和β-内酰胺酶抑制剂复合药(阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦)呈现100%耐药，对氨基糖苷类、喹诺酮类和复方磺胺甲噁唑抗菌药物呈现较低敏感性，对替加环素和新型β-内酰胺酶抑制剂复合药即头孢他啶/阿维巴坦抗菌药物呈现较高的敏感性。见表1。

表1 CRO菌株对临床常用抗菌药物的耐药率(%)

3 讨论

本研究结果提示，ICU、神经外科、泌尿科和烧伤科的患者是CRO感染的高危人群，对这些科室的患者要做好隔离与防护,医务人员要做好手卫生以及环境的清洁与消毒，严防此类菌株在医院和患者之间传播。

采用表型筛选和GeneXpert荧光PCR方法对60株CRO菌株检测结果的比较，mCIM联合eCIM检测结果将1株产2种碳青霉烯酶的弗劳地枸橼酸杆菌检测为仅产金属酶。碳青霉烯酶抑制剂增强试验检测结果与PCR方法的检测结果完全相符，阳性和阴性的符合率均为100%。由此可见，mCIM联合eCIM试验和碳青霉烯酶抑制剂增强试验虽然需时较长(要温育24～28 h)，但操作简便、成本低、无需特殊设备，敏感性和特异性较高，是各级临床微生物实验室常规开展碳青霉烯酶检测的有效表型检测方法。但mCIM联合eCIM试验只能准确检测单一酶，不能准确检测混合酶。而GeneXpert全自动荧光定量PCR检测方法虽操作简单、需时较短(约1 h出结果)、能准确检出CRO携带碳青霉烯酶的基因型，但需要特殊仪器与试剂，成本高，临床微生物实验室常规开展还不现实。

我院CRO菌株的产碳青霉烯酶情况分析显示，其中肺炎克雷伯菌是以产A类丝氨酸碳青霉烯酶、携带KPC型基因为主，产B类金属酶、携带NDM基因为辅，阴沟肠杆菌、大肠埃希菌和雷极普罗威登菌均为产B类金属β-内酰胺酶、携带NDM基因为主，与Zhang等[7]研究结果一致。铜绿假单胞菌主要产B类金属酶,携带IMP1基因为主，占62.5%，与国内多家医院报道的结果基本一致[8-10]。另有4株(铜绿假单胞菌3株和阴沟肠杆菌1株)为阴性结果，很有可能是细菌外膜蛋白的缺失或数量减少并伴有高表达的AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶的产生，有待进一步研究。

结果显示，我院CRO菌株对临床常用抗菌药物中青霉素类、头孢菌素类和β-内酰胺酶抑制剂复合药呈现100%耐药，对氨基糖苷类、喹诺酮类和复方磺胺甲噁唑抗菌药物敏感性较小，对替加环素和新型β-内酰胺酶抑制剂复合药即头孢他啶/阿维巴坦抗菌药物呈现较高的敏感性。调查发现，产A类丝氨酸碳青霉烯酶携带KPC型基因的细菌对头孢他啶/阿维巴坦这种新型加酶抑制复合药均敏感；产B类金属酶的细菌对头孢他啶/阿维巴坦这种新型加酶抑制复合药均耐药，与文献报道内容完全一致[1]。故实验室及时开展CR0耐药机制的检测，并在微生物检验结果的报告单中提示CR0的耐药机制，对临床合理使用抗菌药物十分重要。