超声辅助离子液体提取葡萄籽中蛋白质的方法研究

●刘彦峰 李 霞

（1.甘肃莫高实业发展股份有限公司 甘肃 武威 733008；2.甘肃畜牧工程职业技术学院 甘肃 武威 733008）

葡萄是世界上种植最广泛的水果之一，全世界年产量超过690亿千克［1］，果实可酿酒。酿制葡萄酒的主要副产品是葡萄渣，占葡萄总重量的13%，其中含有38%～52%（以干物质计）的葡萄籽。有研究发现，葡萄籽蛋白质提取物可作为一种有价值的葡萄酒澄清剂［2］。但大多数葡萄籽被当作废料处理。由于葡萄籽蛋白质具有与其他油籽和谷物相似的营养特性，越来越多的学者考虑如何利用葡萄籽蛋白质的营养品质。此外，葡萄籽蛋白质具有良好的溶解性和乳化活性，也可用于食品的生产开发［3］，应用前景 广阔。

随着生物技术的发展，蛋白质提取方法越来越多。碱性提取法作为一种常规方法，其工艺简单，但蛋白质提取率和效率较低，限制了其应用。近年来，食品工业在提高各种来源的蛋白质提取率方面作出了巨大努力。超声波技术在蛋白质提取方面显示出优势，这是由于其能够通过促进质量传递和由于声空化的影响可能导致的细胞壁破裂来增强提取功效。超声波是一种安全、廉价、可重复和可靠、无创和环境友好的技术，还能大大提高生物活性水解物的酶效率和活性。离子液体是一种新型绿色的萃取分离体系，具有黏度低、不易乳化、得率高、萃取化合物范围广、反应条件温和等 优点［4,5］。

本研究通过正交实验对超声波辅助离子液体提取葡萄籽蛋白质各参数进行优化，为葡萄籽蛋白质进一步研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

葡萄籽由甘肃莫高实业发展股份有限公司提供，［Bmim］Cl购自中国科学院兰州化学物理研究所（质量分数＞99%），牛血清白蛋白购自上海源叶生物科技有限公司；浓盐酸，1 mol/L的NaOH，考马斯亮蓝G-250等皆为分析纯。

1.2 主要仪器设备

微型植物试样粉碎机（河北省黄骅市中兴仪器有限公司）；HH-2数显超级恒温水浴锅（深圳市唯品精密仪器有限公司）；H0503型电子天平（邢台智冠机械科技有限公司）；GD820HT小型超声波清洗器（深圳市光点超声波设备有限公司）；6-10R高速离心机冷冻离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；752N紫外-可见分光光度计（济南 好来宝医疗器材有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 脱脂葡萄籽粉末的制备将葡萄籽粉碎后用正己烷/乙醇（体积比3∶1）在40℃下持续搅拌6 h脱脂，脱脂溶剂每2 h更换一次。通过过滤处理的葡萄籽粉末在室温下晾干备用。

1.3.2 离子液体提取葡萄籽蛋白质将脱脂葡萄籽粉末与一定浓度的［Bmim］Cl按照一定料液比混合后，采用一定功率超声波处理一定时间后，过滤取上清液，采用Bradford法测定蛋白质含量，按照以下公式计算蛋白质得率：

其中m1为上清液中蛋白质质量；m2为加入的葡萄籽粉末的质量；V1为测上清液中蛋白质含量时的上清液体积；V2为总上清液体积。

1.3.3 单因素试验采用超声波辅助离子液体提取葡萄籽中蛋白质。分别评价［Bmim］Cl浓度（20%、25%、30%、35%、40%、45%）， 料液 比［1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 （g/mL）］，pH值（2、4、6、8、10），超 声 功 率 （20 W、30 W、40 W、50 W、60 W、70W），超声温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃），超声时 间（3 min、5 min、7 min、9 min、11 min）对蛋白质得率的影响，以获得蛋白质提取率的最 大值。

1.3.4 正交试验以［Bmim］Cl浓度、料液比、超声功率、pH为变量，采用正交试验设计确定变量的最佳组合。正交试验因素水平设计，见 表1。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 [Bmim]Cl浓度对葡萄籽蛋白质得率的影响在料液比为1∶25（g/mL）、pH为6、超声功率为40 W、超声温度为30℃、超声时间为5 min的条件下，改变［Bmim］Cl浓度，对葡萄籽蛋白质得率的影响如图1所示。

如图1所示，蛋白质得率随［Bmim］Cl浓度的增加呈先增加后降低的趋势。离子液体溶液的浓度对细胞壁的溶胀和破坏以及提取液的传质过程有很大影响，能直接决定萃取剂对目标化合物的提取效率。此外，当离子液体的浓度超过一定值时，黏度过高的萃取剂会阻碍目标化合物从葡萄籽粉末到溶液的分散［6］，从而使传质过程更加困难，因此，［Bmim］Cl浓度以35% 为宜。

2.1.2 料液比对葡萄籽蛋白质得率的影响

由图2可知，葡萄籽蛋白质得率随料液比的减小呈先增加后平缓的趋势。这可能是因为料液比的减小促使葡萄籽粉末与液体接触更加完全，使得蛋白质更容易溶于提取液中；但当料液比过小时，葡萄籽蛋白质均已溶于离子液体中，蛋白质得率不发生明显变化。故料液比为1∶30时 蛋白质得率最佳。

2.1.3 pH对葡萄籽蛋白质得率的影响一定浓度离子液体溶液的pH是影响蛋白质提取效果的一个重要因素。结果表明，随着萃取剂pH值的增加，对蛋白质选择性呈现先升高后降低的趋势（图3），这是蛋白质与离子液体间是氢键和静电相互作用的结果［6］。此外，由于萃取剂在调节其酸碱度之前是酸性的，当萃取剂的碱性过强时，大量离子液体会从溶液中沉淀出来，进而影响萃取效果。因此，将离子液体溶液pH调节至6 为宜。

2.1.4 超声功率对葡萄籽蛋白质得率的影响

由图4可知，随着超声功率的增加，析出的葡萄籽蛋白质也就更多；当超声功率为40 W时，蛋白质得率达到最大值；但当超声功率太大时，部分蛋白质可能会变性［7］，与不溶物一起被离心除去。因此，最优超声功率为40 W。

2.1.5 超声温度对葡萄籽蛋白质得率的影响

由图5可知，超声温度在20～35℃范围内，葡萄籽蛋白质得率逐渐升高，之后蛋白质得率随超声温度继续升高而呈现下降趋势。这可能与温度提高后，蛋白质分子运动加速促使其结构拓展［8］，从而可以更快地从原料中分离蛋白质，提高蛋白质提取率有关。但过高的提取温度会引起蛋白质变性和凝胶化，对蛋白质提取产生不利影响。因此，最适宜的超声温度为35℃。

2.1.6 超声时间对葡萄籽蛋白质得率的影响

由图6可知，超声时间从3 min到11 min， 葡萄籽蛋白质得率呈现先升高后降低的趋势。当超声时间为7 min时，蛋白质得率达到最高值。说明适当延长超声时间有利于增加蛋白质的传质效果。超声时间过长可能导致蛋白质提取率降低，这与蛋白质聚集和变性有关［9］。

2.2 正交试验

在利用超声辅助［Bmim］Cl提取葡萄籽蛋白质的单因素试验分析的基础上，进行L9（34）的正交试验，对提取蛋白质的最佳工艺进行探讨。正交试验分析，见表2。

表2 正交试验结果

如表2所示，［Bmim］Cl浓度极差R值最大，说明其对蛋白质提取的率影响最为重要，其次为料液比、超声功率、pH值；依据各因素K值大小，最优组合为A2B1C2D3；在此最优条件下进行多次重复试验，葡萄籽蛋白质的平均得率高于正交试验中的任一组合，最高达9.626 mg/g。

3 结论

本实验建立了一种超声辅助离子液体提取葡萄籽蛋白质的方法，按照料液比1∶25比例加入35%的［Bmim］Cl，在pH为7、超声功率为50 W条件下，葡萄籽蛋白质的得率为9.626 mg/g，可为葡萄籽蛋白质功能特性的进一步研究提供参考依据。