不同大白菜品种对不同地区根肿病菌的抗病性评价

马小超 张 慧 张淑江 李 菲 章时蕃 李国亮 刘希童 孙日飞

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

十字花科根肿病（clubroot disease）是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicaeWoronin）引起的一种重要的世界性土传病害（司军 等，2002）。病菌通过侵染十字花科植物根毛导致根部薄壁细胞增生而形成肿瘤（阿历索保罗 等，2002）。国内外学者已开展了以大白菜、甘蓝等作物为研究对象的根肿病接种方法的研究（李晓鸥 等，1990；Asano et al.，1999，2006；司军等，2003a，2003b；Siemens et al.，2009），以浸根法和注射法居多，但在接种方法的适宜条件上没有进行深入的探讨。本试验在前人研究的基础上，以大白菜根肿病高感品种菊心为试材，比较浸根法和注射法中根系浸泡时间、菌液注射量以及穴盘规格等因素对接种效果的影响，以期建立快速、稳定的大白菜根肿病苗期抗性鉴定技术。

据统计，根肿病危害面积占十字花科作物总面积的1/3 以上，平均产量损失20%～30%，发病严重地块损失可达60%以上（王靖 等，2012）。近年来，根肿病在湖北、云南、四川、贵州、浙江、福建等十字花科蔬菜种植区发生严重，已成为制约我国大白菜、甘蓝、萝卜等十字花科蔬菜生产的重要因素，其中尤以大白菜受害最为严重（李宝聚，2008；龙同 等，2010，2016）。防治根肿病的有效方法有撒石灰（Murakami et al.，2002；Hwang et al.，2011）、调节土壤pH、轮作等，其中选育抗病品种是最经济、安全的手段（Howard et al.，2010）。但是不同地区根肿病菌生理小种变化较大，变异类型多，存在地区进化及分布的差异（Chai et al.，2014）。本试验对15 个在生产上广泛使用的大白菜抗根肿病品种进行多地区根肿病菌接种鉴定，旨在了解不同抗根肿病品种对不同来源地根肿病菌的抗性表现，推动抗根肿病大白菜品种的产业化应用，为大白菜抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所白菜课题组提供，大白菜根肿病高感品种菊心，对多个根肿病菌生理小种均表现高感（柴阿丽 等，2015）；15 个抗根肿病大白菜品种主要来源于中国、韩国、日本，具体品种名称及特征特性详见表1。

表1 供试大白菜品种名称、来源及特征特性

供试根肿病菌取自北京顺义、河南南阳和重庆武隆的田间发病肿根，洗净后装袋，-20 ℃冰箱保存备用。北京顺义、河南南阳根肿病菌由沈阳农业大学园艺学院蔬菜教研室于2020 年5 月采用Williams 鉴别系统鉴定为4 号生理小种；重庆武隆根肿病菌经丁云花等（2013）鉴定，同样为4 号生理小种。

育苗基质在本所农场配制，泥炭土∶珍珠岩∶蛭石为2V∶1V∶1V，进行灭菌处理后备用。

1.2 试验方法

试验于2020 年4—8 月在本所南苑人工气候室进行。

1.2.1 根肿病菌孢子悬浮液的制备 参考柴阿丽等（2015）的方法并略有修改。取-20 ℃冰箱保存的大白菜根肿组织，置于室温条件下解冻，促使其休眠孢子萌发；用剪刀将其剪碎，与蒸馏水一起加入组织捣碎机，每15 g 根肿组织需100 mL 蒸馏水，打磨成浆后用8 层纱布过滤，弃掉滤渣；将滤液装入50 mL 离心管中，4 ℃、3 000 r·min-1离心8 min，弃上清液，用蒸馏水悬浮沉淀，重复2次；利用汤麦式血球计数板计算休眠孢子悬浮液浓度，调节至每个中格含有240 个休眠孢子，即孢子悬浮液浓度为3×108个·mL-1，4 ℃保存，24 h 内使用。

1.2.2 注射接种法适宜接种条件的筛选 以根肿病高感品种菊心为试材，以北京顺义根肿病菌为接种菌源，于2020 年4 月15 日在本所南苑人工气候室进行试验。先用刮板将灭菌后的育苗基质均匀装入穴盘（规格为长54 cm，宽28 cm，高6 cm）中，采用压穴器在每个穴孔中央按压出1 cm 深的孔洞，浇透底水，然后人工点播菊心种子，每穴1～2 粒，播后覆盖一薄层育苗基质与格室相齐平；播种后6 d 左右间苗，每穴保留1 株，幼苗两叶一心期（播种后10 d 左右）使用10 mL 的一次性无菌注射器对幼苗根际注射根肿病菌孢子悬浮液。接种前1 d 浇透水，接种后3 d 内不能浇水；接种后的幼苗置于25～30 ℃人工气候室内，16 h/8 h（昼/夜）光周期培养，穴盘底部垫有相同规格托盘，托盘中灌有pH=6 的盐酸水，使基质含水量保持在90%以上；接种14 d 后撤掉托盘，之后按需浇水。接种40 d 后调查根肿病发病情况。

对注射量和穴盘规格进行筛选优化，注射量设置1、2、3、5 mL 4 个水平，穴盘规格设置32、50、72 孔3 个水平，两因素交互作用，共计12 个处理组合；以注射2 mL 无菌水、选用72 孔穴盘为对照，采用随机区组排列，每处理45 株，3 次重复。

1.2.3 浸根接种法适宜接种条件的筛选 同样以菊心为试材，以北京顺义根肿病菌为接种菌源，2020年4 月15 日在本所南苑人工气候室进行试验。先在铺有单层滤纸的培养皿中对菊心种子进行催芽，滤纸保持湿润，室温条件下催芽4～5 d；待根长约1 cm 时，移入装有根肿病菌孢子悬浮液20 mL 的培养皿中，使根系完全浸没，浸根一定时间后用镊子夹取种芽根部，轻轻插入装有无菌育苗基质的穴盘中。接种后的幼苗管理方法同1.2.2。接种40 d后调查根肿病发病情况。

对浸根时间和穴盘规格进行筛选优化，浸根时间设置15 s 和5、15 min 3 个水平，穴盘规格设置32、50、72 孔3 个水平，两因素交互作用，共计9个处理组合；以无菌水浸泡为对照，采用随机区组排列，每处理45 株，3 次重复。

1.2.4 大白菜品种抗病性鉴定 2020 年7 月10 日在本所南苑人工气候室，采用优化后的浸根接种法对15 个抗根肿病大白菜品种进行接种鉴定，以北京顺义、河南南阳和重庆武隆根肿病菌为接种菌源。每穴1 株，每份材料每处理10 株，2 次重复。接种方法同1.2.3，接种后幼苗管理同1.2.2。接种40 d 后调查根肿病发病情况。

1.3 根肿病病情分级标准

病情分级标准、病情指数计算方法及抗性评价标准参考Hui 等（2015）的方法。病情分级标准：0 级，根部无肿大现象；1 级，侧根根部有少量小肿瘤；2 级，侧根根部有较大肿瘤或主根上有小肿瘤；3 级，主根和侧根都出现严重的肿大（图1）。抗性评价标准：免疫（I），病情指数=0；高抗（HR），0 ＜病情指数≤11.11；抗病（R），11.11 ＜病情指数≤33.33；感病（S），33.33 ＜病情指数≤55.55；高感（HS），病情指数＞55.55。

图1 大白菜苗期根肿病病情分级标准

病情指数=Σ（各级病株数×相对病级）/（调查总株数×最高病级）×100

发病率=（发病株数/总株数）×100%

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0 软件处理试验数据，应用Duncan 氏新复极差法进行显著性检验，使用Excel 2013 软件做图。

2 结果与分析

2.1 注射接种法适宜接种条件的筛选

从表2 可以看出，在菌液注射量相同时，不同穴盘规格处理的大白菜根肿病病情指数和发病率均无显著差异；3 个穴盘规格水平下，5、3、2 mL 菌液注射量处理的病情指数和发病率均显著高于1 mL 注射量处理；当菌液注射量为2 mL 时，选用72 孔穴盘，发病率和病情指数最高，分别为97.92%和81.94。因此，推荐使用2 mL 菌液注射量和72 孔穴盘作为注射接种法接种大白菜根肿病菌的最佳方案。

表2 不同菌液注射量和穴盘规格对大白菜根肿病室内苗期人工接种鉴定效果的影响

2.2 浸根接种法适宜接种条件的筛选

由图2 可知，浸根时间为15 min 和5 min 时，不同穴盘规格处理的大白菜根肿病病情指数均在80 以上，且处理间无显著差异；浸根时间为15 s时，3 个穴盘规格处理的病情指数均显著低于浸根15 min 和5 min 处理。比较而言，选择浸根时间5 min 和任意穴盘规格，即可使幼苗完全发病且病情指数稳定在80 以上。

图2 不同浸根时间和穴盘规格对大白菜根肿病室内苗期人工接种鉴定效果的影响

2.3 不同大白菜品种抗病性鉴定结果

从表2、图2 可以看出，相对于注射接种法，采用浸根接种法接种的大白菜根肿病病情指数更高、稳定性更好，且节省菌液。因此，本试验选用优化后的浸根接种法对15 个抗根肿病大白菜品种进行接种鉴定，以菊心为感病对照。

从表3 可以看出，不同大白菜品种对同一来源地根肿病菌的抗性表现存在差异，且同一品种对不同来源地根肿病菌的抗性表现也不尽相同。15 个抗根肿病大白菜品种中，对河南南阳根肿病菌表现高感的品种有10 个，抗病的3 个，高抗的2 个；对北京顺义根肿病菌表现高感的品种有7 个，感病的3 个，抗病的2 个，高抗的1 个，免疫的2 个；对重庆武隆根肿病菌表现高感的品种有6 个，感病的1 个，抗病的6 个，高抗的2 个。抗病性表现较强（包括抗病、高抗、免疫）的品种在3 个不同菌源处理中所占比例分别为33.3%、33.3%和53.3%。从菌源致病力来看，河南南阳根肿病菌的致病力相对较强，重庆武隆根肿病菌的致病力较弱。

从表3 还可以看出，CR 惠民、CR 利民、德高CR117 均对三地菌源表现出较强的抗性，猜测这3 个品种含有多个微效抗病基因，具有广谱抗性。其中，德高CR117 对北京顺义根肿病菌表现免疫。而CR 福星、CR 美妮、CR 奈良、盛春以及高原绿等品种对三地菌源均表现为高感，猜测这5个品种可能不含抗根肿病菌4 号生理小种的基因。此外，部分参试品种具有垂直抗性特点，对某一来源地的根肿病菌具有专一抗性。如CR 高冷地、CR根宝、CR 金佰利、德高CR1138、根王、万清克肿皇等品种对三地菌源的抗性表现差异较大，均存在抗病表现和感病表现，猜测这6 个品种的根肿病抗性由单个或者少个主效抗病基因控制。

表3 不同抗根肿病大白菜品种对3 个地区根肿病菌的抗性鉴定结果

本试验中，来自本土产地的品种9 个，来自韩国的品种5 个，来自日本的品种1 个。韩国品种的抗、感表现差异较大，CR 利民和CR 惠民对三地菌源表现完全抗病，而其余品种表现全部感病；日本品种CR 奈良对三地菌源全部表现高感；本土产地品种中德高CR117 等7 个品种对三地菌源均有不同程度抗性。

3 讨论与结论

根肿病菌的接种浓度是影响接种效果的重要因素。丁云花和简元才（2005）、丁云花等（2013）在进行接种方法比较以及对8 个省市根肿病菌生理小种进行鉴定时分别选用2 mL 注射量、孢子浓度为1×108个·mL-1，或1 mL 注射量、孢子浓度为1×107个·mL-1的菌液接种，接种效果良好，植株稳定发病。汪维红等（2013）在对湖北长阳县根肿病菌生理小种进行鉴定时选用1 mL 注射量、孢子浓度为1×107～1×108个·mL-1的菌液接种，结果稳定可靠。柴阿丽等（2015）进行接种方法比较时则选用5 mL 的孢子浓度3×108个·mL-1菌液进行灌根接种，发病率和病情指数最高。朱红芳等（2016）发现根肿病菌孢子浓度达到4×108个·mL-1时，发病率和病情指数开始降低。比较而言，本试验为保证植株稳定发病且减少根肿病菌浓度对其他因素的影响，选择孢子浓度3×108个·mL-1为本试验的菌液接种浓度。

针对注射法接种，对比张淑霞等（2010）1 mL 注射量的设置，且发病率及病情指数均较低的接种结果，本试验设置了1、2、3、5 mL 注射量4个水平，旨在探索节约菌液且植株高效发病的最佳条件。试验中观察到，72 孔穴盘规格处理的大白菜根肿病发病率略高，2 mL 以上注射量发病效果显著，且随着注射量升高并无显著变化。分析原因可能是穴孔较小，在注射菌液时容易使根系接触到根肿病菌，感病率提高，并且注射量到达一定程度后基质中的菌液浓度趋于饱和。注射法中各处理标准差浮动不大，且2 mL 以上注射量病情指数与发病率相对于灌根法（朱红芳 等，2016）较稳定，可能是因为注射法相对于灌根法接种部位更精准。另外，相对于索欢等（2016）直接播种后进行注射，本试验在幼苗两叶一心期进行菌液注射的效果较好，因为该时期根毛较密集，可以更充分地与新鲜菌液接触，促进根肿病菌对根毛的侵染。接种后3 d 内浇水可能会将基质中的新鲜根肿病菌冲洗掉，降低发病率。为保证萌发后的游动孢子侵染根毛，可在接种后前2 周将穴盘放入装有适量盐酸水的托盘中，加速游动孢子的移动，之后去掉托盘促进空气流通，确保植株正常生长。

针对浸根法接种，结合李晓鸥等（1990）、Fredua-Agyeman 等（2020）关于浸根时间2～3 min和10～20 s 的描述，同时发现柴阿丽等（2015）设置的15、30、45、60 min 浸根时间梯度较长，且在浸根30 min 时发病率及病情指数也趋于平稳，本试验设置了15 s 和5、15 min 浸根3 个水平进行比较，发现浸根时间小于15 min 同样具有较高的发病率和病情指数。采用浸根法接种时观察到，根系浸泡5 min 以上的发病效果显著高于浸泡15 s，且随着浸根时间的延长，病情指数与发病率趋于平稳，浸根5 min 时发病率即可达到100%。说明浸根时间越长，根系与菌液接触越稳定，且一段时间后根系完全被菌液包裹趋于饱和。浸根15 s 时，植株发病不稳定，可能是浸根时间较短，菌液和根系的接触不充分所致。

针对15 份大白菜品种的抗性鉴定试验，接种方法采用了节约菌液且优化后的浸根法。供试菌源采自河南南阳及重庆武隆发病严重地块的大白菜生产田，北京顺义根肿病菌采自本所试验基地中发病的大白菜肿根（发病原因可能是育苗时期基质带菌所致）。试验中观察到，虽然三地根肿病菌经鉴定均为4 号生理小种，但参试大白菜对三者的抗病性表现不一致，例如CR 高冷地、CR 根宝、CR 金佰利、德高CR1138、根王、万清克肿皇等对三地根肿病菌的抗性表现均不相同。猜测可能的原因是Williams 鉴别系统具有一定局限性，无法将致病力更强的生理小种区分开来。CR 惠民、CR 利民和德高CR117 对三地菌源均表现出较强的抗性，其中德高CR117 对湖北枝江等8 个根肿病重发区（曾令益等，2017）及湖北长阳县（汪维红 等，2013）的根肿病菌同样表现高抗性；CR 惠民在谭翀和岳艳玲（2013）的报道中对云南安宁、玉溪地区根肿病菌具有抗性；CR 利民同样对多个地区根肿病菌具有抗性，例如山东青岛、云南昆明等地（张淑霞 等，2018）。猜测这3 个品种含有多个抗病基因，因而对多个来源地的根肿病菌表现抗性。而CR 美妮和CR 福星对三地菌源均表现感病，且王新月（2017）同样报道了这2 个品种对太白高山地区的根肿病菌4 号生理小种表现感病，说明CR 美妮与CR 福星可能不含抗根肿病菌4 号生理小种的基因。

不同大白菜品种抗性鉴定结果初步明确了部分抗病大白菜品种对3 个不同地区根肿病菌的抗性，为相应的抗病大白菜品种的利用提供了依据。今后还需对各地菌源的小种类型及相应抗病品种的抗病基因型之间的关系进行探讨，为大白菜抗根肿病育种提供参考。