家庭自制酵素中的微生物污染检测

何 曼，李 松，仇 雨，周 璇，陈丽丽

（1.南华大学，湖南衡阳 421000；2.南华大学衡阳医学院，公共卫生学院，湖南衡阳 421000）

酵素产品主要盛行于日本、美国、一些欧洲国家及东南亚地区，且形成了品牌产业规模。近十多年来，在中国开始盛行，越来越多的酵素理念被引入到农业、食品、美容保健等领域[1-2]。酵素是用果蔬、菌菇或中草药等作为原材料，通过发酵，形成富含矿物质、氨基酸、多种酶、乳酸、醋酸和少量乙醇等代谢产物的液态和固态食品[3-4]。

酵素富含大量脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶、乳酸、醋酸、少量乙醇等代谢产物、酚类和黄酮类等生物活性成分，植物酵素中还有大量的抗氧化成分和多种营养物质[5-6]。不同原料酵素具有的功能不相同，如桑葚酵素可以补益肾肝、延缓衰老[7-8]；猕猴桃酵素能够安神益智、美容养颜[9]；黑加仑酵素能够预防高血压，心脏病，具有较强的抗氧化能力[10-11]。

酵素因为其众多的功效而受到很多人的青睐，近年来，家庭自制酵素越来越流行。但自制酵素由于没有对其生产条件进行严格地控制，在生产和贮存过程中容易受到微生物污染，微生物的污染程度与贮存的时间密切相关。被污染的酵素其食用价值和功效价值将会受到影响，也会对人体的健康造成危害。为评价家庭自制酵素的卫生微生物指标合格情况，本项目收集了6家3种不同原材料的酵素，检测不同贮存时间后的感官性状、pH值、菌落总数、大肠菌群数、霉菌和酵母数。

1 材料与方法

1.1 材料

普通营养琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤和煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司。

实验所用酵素为6个家庭的自制酵素，包括苹果、香蕉、红心火龙果酵素，制备过程均为将各种原材料洗净沥干，切碎（＜0.5 cm3），加入酵素桶中，用无菌水溶解白砂糖后加入，搅拌均匀后，密封发酵7 d而成。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤，按试剂说明书配制，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，分装后备用。

1.2.2 pH测定

取少量样品用酸度计（sartorius PB-10）进行测定。

1.2.3 样品稀释处理

用1 mol/L的NaOH溶液调节样品pH值，使其在6.5～7.5，以无菌操作，分别取贮存0 d、5 d、10 d、15 d、20 d的各种酵素25 mL于装有225 mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内，充分振荡，制成1∶10的均匀稀释液。用灭菌吸管吸取1∶10稀释液1 mL，加入含有9 mL灭菌生理盐水的试管内，振荡试管，混合均匀，做成1∶100的稀释液。另取1 mL灭菌吸管，按上述操作，制成10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌吸管。

1.2.4 菌落总数测定

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016），测定样品中菌落总数[12]。根据食品卫生标准要求对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，取1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。加入约15 mL，46 ℃左右的营养琼脂培养，转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1 mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，在（36±1）℃温箱内培养（48±2）h。

1.2.5 大肠菌群检测

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016）的MPN法，测定样品中大肠菌群数[13]。

（1）初发酵实验。每个样品选择3个适合的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1 mL，（36±1） ℃培养（24±2） h，观察管内是否产生气泡，（24±2） h产气者进行复发酵实验，如未产气则继续培养至（48±2）h，产气者进行复发酵实验，未产气者为大肠菌群阴性。

（2）复发酵实验（证实实验）。用接种环从产气的LST肉汤管分别取培养物1环，移种于BGLB肉汤中（36±1）℃培养（48±2） h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

根据确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索大肠菌群MPN表，报告每mL样品中大肠菌群的MPN值。

1.2.6 霉菌和酵母菌计数

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB4789.15—2016），测定样品中霉菌和酵母菌数[14]。根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，每个稀释度取1 mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。加入46 ℃马铃薯葡萄糖培养基，并转动平皿使混合均匀。同时将马铃薯葡萄糖培养基倾入加有1 mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，在（28±1）℃温箱内培养5 d。

2 结果与分析

2.1 感官指标

本次实验共检测苹果、火龙果和香蕉酵素，每种2个样品，共6个样品。其中苹果和香蕉酵素均呈乳白色，火龙果酵素呈紫红色，具有该水果特有的芳香性气味，pH均小于4，无肉眼可见的外来杂质。

2.2 菌落总数

由表1可知，本实验检测的3种自制酵素中菌落总数含量均达104CFU/mL以上，且随着保存时间的延长，菌落总数呈现先增加后减少再增加的趋势如图1所示。

表1 不同原材料酵素样品菌落总数（单位：CFU/mL）

图1 不同原材料酵素样品菌落 总数变化趋势

此外，不同原料的自制酵素菌落总数达到最大值的时间不同，苹果酵素在第10 d时的菌落总数达到最大值，火龙果和香蕉在第5 d达到最大值。

2.3 大肠菌群数

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016）的MPN法，测定了样品中大肠菌群数，发现样品中的大肠菌群数均小于3，见表2。

表2 不同原材料酵素样品中大肠菌群数（单位：MPN/mL）

2.4 霉菌数

由表3可知，苹果酵素和火龙果酵素的霉菌数量均大于20 CFU/mL，最大为350 CFU/mL；香蕉酵素的霉菌数量小于20 CFU/mL；随保存时间的延长，霉菌数量无明显变化规律。

表3 不同原材料酵素样品霉菌数（单位：CFU/mL）

2.5 酵母菌数

按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016），测定样品中的酵母菌数。由表4可知，每种自制酵素样品中酵母菌的含量均较高，均超过10 CFU/mL。在发酵过程中呈现先增加后减少的趋势如图2所示。

表4 不同原材料酵素酵母菌数（单位：CFU/mL）

图2 不同原材料酵素样品 酵母菌数变化趋势

3 结论与讨论

（1）本实验共收集了6个家庭自制的3种酵素样品，先观察其感官性状，并检测其pH值，发现苹果和香蕉酵素均呈乳白色，火龙果酵素呈紫红色，具有该水果特有的芳香性气味，pH均＜4，无肉眼可见的外来杂质。与中国生物发酵产业协会食用植物酵素团体标准食物酵素[15]中关于感官性状的要求：自制酵素应具有产品应有的色泽，滋味且无肉眼可见的杂质，pH＜4相吻合。

（2）菌落总数为卫生微生物指示性指标之一，用来判定食品样品被微生物污染的程度及卫生质量。菌落总数一定程度上能够反映食品的新鲜程度、是否变质以及生产过程的卫生状况等，人体长期食用菌落总数超标的食物，可能会引起胃肠道疾病。本实验检测的6个酵素样品菌落总数均在104CFU/mL以上，且随着保存时间的延长，菌落总数呈先减少后增加的趋势。T/CBFIA 08003—2017食物酵素[16]要求：酵素中菌落总数小于102CFU/mL，检测的自制酵素样品的菌落总数均超标。酵素在制备的过程中，随着发酵时间的延长，pH值逐渐下降，酵素产品的pH均＜4，然后在贮存过程中，由于微生物的繁殖，pH值逐渐增高，而细菌最合适的pH条件为7.2左右，导致随着保存时间的延长菌落总数先减少后增加。

（3）大肠菌群主要来源于人和温血动物粪便，可以指示肠道传染病传播的可能性。本实验6个样品中的大肠菌群数均＜3，说明制作过程中不存在粪便污染，肠道疾病传播的可能性较小。

（4）霉菌和酵母菌是发酵食品中常见的微生物，少量的霉菌和酵母不会造成食品质量安全事故。但是霉菌过度生长会造成食品霉变，酵母菌污染会导致产品胀包、腐败及风味的改变，给食品质量和安全带来影响。酵母菌和霉菌过度繁殖会影响食品的风味，许多霉菌的代谢产物具有很强的毒性，甚至致癌。T/CBFIA 08003—2017食物酵素的标准[15]要求霉菌的数量小于20 CFU/mL，本实验中香蕉酵素霉菌总数均小于20 CFU/mL，而苹果和火龙果酵素中霉菌数量均大于20 CFU/mL，最大达350 CFU/mL，这可能与水果的水分和含糖量有关，一般含糖高、水分高的食物更利于霉菌的生长。酵素中的酵母菌含量较高，呈现随保存时间延长先增加后减少。酵母菌前期数量的增加可能是因为在发酵过程中添加了大量的白砂糖，酵母菌可以利用糖类物质进行生长和繁殖，然后糖类的量减少，醇类和酸类物质增多，酵母菌的生长受到抑制，导致其数量减少[16]。

目前，食品安全已经成为了广泛关注的问题，而微生物污染是影响食品安全最重要的因素。食品中微生物污染情况的检测是防止微生物污染食品流入市场、保障人们身体健康的关键措施。因此，加强食品微生物污染检测至关重要。

通过对家庭自制酵素的主要卫生微生物指标的测定，发现自制酵素产品的菌落总数、霉菌和酵母总数均超标，提示食用自制酵素有一定的健康风险。自制酵素的制作应严格把控酵素的生产、贮存条件，尽量通过正规渠道购买合格、安全的产品，使酵素以最低的安全风险发挥其最大的食用价值。