LC-MS/MS法同时测定肾移植患者血浆中霉酚酸及两种代谢物浓度

蒋振伟，杨旭萍，蒋艳，凌静，董露露，邹素兰，陈荣，胡楠（常州市第一人民医院药学部，江苏 常州 213003）

霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）是由青霉菌发酵生成的有机弱酸，在体内通过抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的活性，阻断嘌呤核苷酸的合成，抑制T、B 淋巴细胞的增殖，从而发挥免疫抑制效应[1]。MPA 在体内主要通过尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（uridine diphosphate glucuronyl-transferase，UGT）代谢为葡萄糖醛酸化物（MPA-glucuronide，MPAG）和酰基化的葡萄糖醛酸化物（acyl-MPAglucuronide，AcMPAG）[2]，各化合物结构见图1。MPA 的药动学个体间差异较大，且浓度与疗效和不良反应有关[2]，治疗药物监测具有重要意义。MPAG、AcMPAG 与MPA 游离药物浓度、肝肠循环及二次峰浓度等有密切关联[3-4]，因此测定上述三者血药浓度于MPA 血药浓度监测、指导临床合理用药有实际意义。现有的关于MPA 及其代谢物血药浓度测定的方法基本是测定其中的单一化合物。同时测定MPA、MPAG、AcMPAG 有助于提高测定效率和药物检测时效。本研究建立了同时测定血浆中三者浓度的LC-MS/MS 法。

图1 MPA、MPAG、AcMPAG 及MPA-d3 的化学结构Fig 1 Chemical structure of MPA，MPAG，AcMPAG and MPA-d3

1 材料

1.1 仪器

Jasper HPLC 液相色谱仪，Triple Quad 4500MD三重四极杆串联质谱仪（AB SCIEX，美国），Vortex-Genie 2 涡旋混合器（Scientific industries，美国），5417R 低温高速离心机（Eppendorf，德国），Direct-Q 纯水仪（Millipore，美国），BT25S 电子分析天平（Sartorius，德国）。

1.2 试药

MPA（纯度：98%， 批号：3-BKG-19-1）、MPAG（纯度：96%，批号：2-FAI-5-1）、AcMPAG（纯度：95%，批号：6-PQY-99-1）（Toronto Research Chemicals 公司），内标MPA-d3（纯度：98%，批号：3-ACA-246-4，Cmass 公司）。甲醇（色谱纯，Merck公司）；甲酸和乙酸铵（分析纯，Sigma-Aldrich 公司）；纯水由Milli-Q 超纯水系统制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kinetex C18（3 mm×100 mm，2.6 μm，Phenomenex，USA），流动相A：水（0.1%甲酸，10 mmol·L－1乙酸铵），流动相B：甲醇（0.1%甲酸），梯度洗脱：0～0.8 min，60%A；0.8～3.8 min，0%A；3.8～4 min，60%A；4～5 min，60%。流速：0.55 mL·min－1，柱温：40℃。

2.2 质谱条件

ESI 正离子检测模式，多反应监测（MRM）扫描。各成分选用的离子对和DP、CE 电压如下：

MPA：m/z321.0 →303.2，75 V 和15 V；MPAG：m/z514.0 →303.3，30 V 和18 V；AcMPAG：m/z514.0 →207.0，30 V 和50 V；内标MPA-d3：m/z324.1 →306.0，110 V 和15 V。

2.3 对照品储备液的配制

取MPA 5 mg、MPAG 2.5 mg、AcMPAG 0.5 mg，加入适量甲醇溶解，配制成MPA、MPAG 及AcMPAG 质量浓度分别为5、5、0.5 mg·mL－1的对照品储备液。分别取对照品储备液适量，混合配制成MPA、MPAG 及AcMPAG 质量浓度分别为0.5、2、0.4 mg·mL－1混合对照品储备液。

2.4 血浆样品处理

取血浆50 μL，加入5 μL 内标MPA-d3（10 μg·mL－1），再加入200 μL 甲醇-乙腈溶液（9∶1），涡旋震荡3 min，16 400 r·min－1离心10 min，取上清液20 μL，加入50%甲醇溶液180 μL，涡旋30 s，16 400 r·min－1离心10 min，取上清液100 μL 进样。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性 取6 份不同来源的人空白血浆、加入对照品储备液的人血浆样品、用药后的血浆样品按照“2.4”项下方法处理分析。结果MPA、MPAG、AcMPAG 和内标（MPA-d3）的保留时间分别为2.8、2.39、2.58 和2.79 min，血浆中内源性物质在待测物保留时间内无干扰，结果见图2。

图2 血浆中MPA、MPAG、AcMPAG 和内标MPA-d3 的LC-MS/MS 色谱图Fig 2 LC-MS/MS chromatogram of MPA，MPAG，AcMPA and MPA-d3 in the plasma

2.5.2 标准曲线和定量限 精密量取混合对照品储备液适量，加甲醇稀释成含MPA（2、4、10、25、50、100、250、500 μg·mL－1），MPAG（10、20、50、125、250、500、1250、2500 μg·mL－1），AcMPAG（0.8、1.6、4、10、20、40、100、200 μg·mL－1）的混合工作溶液。取混合工作液5 μL，加入空白血浆45 μL，制备标准系列溶液。按“2.4”项下方法处理。以待测物与内标物峰面积比Y为纵坐标，待测物质量浓度X（μg·mL－1）为横坐标，以加权（W＝1/χ²）最小二乘法进行线性回归运算，结果MPA 标准曲线为：Y＝3.754X＋0.3733（r＝0.9926）；MPAG标准曲线为：Y＝0.4653X＋0.1271（r＝0.9941）；AcMPAG 标准曲线为：Y＝0.2891X＋4.441×10－4（r＝0.9942）；MPA、MPAG、AcMPAG 的定量限分别为0.2、1、0.08 μg·mL－1。

2.5.3 精密度与准确度 取混合对照品储备液，配制成含MPA（5、80、400 μg·mL－1）、MPAG（25、400、2000 μg·mL－1）和AcMPAG（2、32、160 μg·mL－1）的低、中、高浓度的质控工作液。取混合质控工作液5 μL，加入空白血浆45 μL，按“2.4”项下方法处理，每个浓度取6 份，在2周内测定3 次。根据当日的标准曲线计算日内和日间精密度、准确度，结果见表1。

表1 MPA、MPAG、AcMPAG 的准确度及精密度(n ＝6)Tab 1 Accuracy and precision of MPA，MPAG and AcMPAG (n ＝6)

2.5.4 提取回收率和基质效应 取“2.5.3”项下3个浓度的质控QC 工作液，进样测得待测物峰面积比值A1。取空白血浆进行预处理后的上清液，加入低、中、高浓度的混合质控样品（包括内标），每个浓度6 份，测得待测物峰面积比值A2。峰面积比A1/A2可求得3 种浓度待测物的提取回收率。取不同人空白血浆6 份，加入低，中，高浓度质控样品溶液，每个浓度6 个待测样品，按“2.4”项下方法处理，测得待测物峰面积比值A3，基质效应为A2/A3，结果MPA、MPAG 和AcMPAG 的提取回收率及基质效应RSD均符合方法学要求。

2.5.5 稳定性 考察了室温稳定性，4℃稳定性，冻融稳定性及进样器稳定性。取“2.5.3”项下3个浓度的质控工作液各5 μL，每个浓度6 份，加入人空白血浆，分别在室温下放置6 h；在4℃下放置24 h；在－80℃，反复冻融3 次，按“2.4”项下方法处理后进样测定，结果MPA、MPAG 和AcMPAG 质量浓度的RSD均在±15%范围内，表明MPA 及其代谢物在本实验条件下稳定。

2.6 药动学研究

7 例肾移植患者，术后免疫抑制剂方案均采用他克莫司（FK506）＋霉酚酸酯（MMF）＋糖皮质激素三联用药。MMF 在肾移植术前12 h 内开始口服1000 mg bid；术中及术后1 d 静脉滴注甲基强的松龙500 mg·d－1，术后第2日或者第3日减为250 mg·d－1，后口服泼尼松片40 mg/（kg·d），逐渐减量至10～20 mg/（kg·d），他克莫司剂量为0.07～0.15 mg/（kg·d）bid。于本方案治疗1 周后，于末次给药后0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 采集血浆样本测定MPA、MPAG 和AcMPAG 浓度。用WinNonlin 软件的非房室模型进行拟合求算Cmax、tmax、t1/2、AUC及平均驻留时间（MRT）等药动学参数。实验数据以mean±SD 表示，结果见表2及图3。

表2 7 例肾移植患者服用霉酚酸酯后MPA 和代谢物的药动学参数Tab 2 Pharmacokinetic parameters of MPA and metabolites after the oral administration of MMP in 7 renal transplant patients

图3 肾移植患者口服霉酚酸酯后MPA、MPAG、AcMPAG 的血药浓度-时间曲线Fig 3 Mean plasma concentrations-time curve of MPA，MPAG and AcMPAG in renal transplantation patients after the oral administration of MMP

3 讨论

目前临床上应用的MPA 类药物主要有霉酚酸酯（MMF）肠溶片和霉酚酸钠肠溶片（ECMPS）[5]，MMF 是无活性的前体药物，口服后经胃肠道吸收，水解生成活性代谢产物MPA。霉酚酸类药物具有非线性药动学特征，在不同患者体内药动学差异较大，需要通过血药浓度监测调整给药剂量。MPA 的血药浓度-时间曲线下面积（AUC）的理想范围在30～60 μg·h·mL－1，大于60 μg·h·mL－1时易发生胃肠道、骨髓抑制等相关不良反应，而小于30 μg·h·mL－1时发生急性排斥反应的风险增加[6]。研究表明代谢物MPAG 会影响MPA 的药动学特征，AcMPAG可能与MPA 的毒副作用有关[7-8]。MPAG 会与MPA 竞争蛋白结合影响MPA 的游离浓度。AcMPAG 可能通过抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、白细胞的增殖和诱导细胞因子的释放表现出生物活性，服用MMF 后引起的白细胞减少和胃肠道功能紊乱可能与 AcMPAG 相关[9]。因此对MPA及其代谢物的检测具有一定的临床意义。

目前国内外测定MPA 及其代谢物的方法主要有HPLC 法、LC-UV 法以及酶放大免疫法（EMIT）[10]。免疫法方便快捷，但是特异性不强，测定MPA 及其代谢物时，会与AcMPAG 发生交叉反应使MPA 浓度偏高。HPLC 法具有较高的灵敏度和特异性，是测定MPA 及其代谢物的一种标准方法，但检测过程耗时较长。本实验选择LC-MS/MS 测定MPA 及其代谢物浓度，相较于HPLC 和EMIT 法，LC-MS/MS 法不需要使用昂贵的抗体，可以缩短测定时间，样本处理方法简单，同时具有更好的特异性和灵敏度。

在方法优化过程中尝试了多种流动相，包括水-甲醇、 水-乙腈、 水（0.01%甲酸，10 mmol·L－1乙酸铵）-甲醇（0.01%甲酸）、水（0.1%甲酸，5 mmol·L－1乙酸铵）-甲醇（0.1%甲酸），最终选择流动相A：水（0.1%甲酸，10 mmol·L－1乙酸铵），流动相B：甲醇（0.1%甲酸），通过加入甲酸和乙酸铵使得MPA 及其代谢物的色谱峰形和响应值得到改善。对于洗脱方式，尝试了等度洗脱与梯度洗脱，相对等度洗脱，梯度洗脱有更好的峰形以及分离度。通过调整初始有机相比例得到了较为合适的保留时间，避免与杂质共同洗脱从而减少了基质效应的干扰。笔者查阅相关文献，发现大部分研究对于MPA、MPAG 和AcMPAG 母离子的选择都是[M-H]－离子[11-14]，而在质谱条件摸索时发现MPA 的[M ＋H]＋离子，MPAG 和AcMPAG 的[M ＋NH4]＋离子也有很好的响应，能够满足MPA 血药浓度测定的需要。MPAG 和AcMPAG 都是霉酚酸的葡萄糖醛酸化代谢物，互为同分异构体具有相同的分子量，刘晓雪等[11]建立的肝移植患者血浆MPA及其代谢物的LC-MS/MS 检测方法中MPAG 和AcMPAG 共用同一个离子对，笔者在实验中发现了两种代谢物的不同的离子对，每个代谢物在各自的离子对下都具有较高的响应，可以更好地对MPAG 和AcMPAG 进行定性和定量。对于内标的选择，本实验选择稳定同位素内标MPA-d3，相对于吲哚美辛内标[11]，MPA-d3 的理化性质与待测物最相近，表现为相似的回收率、离子化效率和色谱保留行为，并且无内源性干扰，受到基质效应的干扰更小。