孕鼠补充高羊毛氨酸硒对新生乳鼠十二指肠和空肠抗氧化功能的影响

韩昊洋，丁涛，董俊升，崔璐莹，孟霞，李建基，朱国强，王亨*

(1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2. 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏 扬州 225009；3. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

硒作为动物体内一种必需的微量元素，在抗氧化防御、抵抗炎症反应、甲状腺激素活化、DNA合成、生育和生殖等生物学功能中发挥重要作用[1-2]。机体内硒的主要来源是通过饮食获取，并由小肠吸收进入血液，其中以十二指肠及空肠的吸收率最高[3]。目前，畜禽饲料中主要以无机硒(亚硒酸钠)和有机硒(蛋氨酸硒)两种形式添加。无机硒用于饲料添加时，与有机硒相比，效率低，潜在毒性高[4]。高羊毛氨酸硒(selenohomolanthionine, SeHLan)是在日本辛辣萝卜中发现的新型含硒氨基酸，与蛋氨酸硒相比，其代谢途径更直接，主要参与硒蛋白的合成，生物利用率高，毒性低[5]。新生胎儿的硒水平与母体的硒摄取量密切相关。在妊娠期，硒经血液循环，透过胎盘屏障供给胎儿；哺乳期，硒经乳汁转移到幼儿[6]。新生胎儿肠道是生长发育所必需营养物质的重要摄取场所，因其发育不全，易受氧化物和自由基的攻击，引起肠功能障碍，导致代谢紊乱，影响动物体生长和发育[7]。硒作为多种硒蛋白的主要组成，能清除动物体内代谢产生的氧自由基，维持机体内环境的稳态，促进新生胎儿正常的生长发育。日粮中，添加0.15 mg/kg的硒，是能满足大鼠正常生理状态的摄入量，并且进行超高剂量硒的大鼠毒性试验中发现，超过5 mg/kg的日粮硒会产生毒性作用[8]。本试验通过饲喂无硒基础饲料，并通过在孕鼠饮水中分别添加0.03、0.15和1.5 mg/kg的高羊毛氨酸硒补充日粮硒，探讨其对新生乳鼠十二指肠和空肠抗氧化能力的影响，为高羊毛氨酸硒在畜禽养殖和宠物饲养中的应用提供理论研究依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高羊毛氨酸硒购自英联贸易(上海)有限公司，无硒基础饲料购于常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.2 实验动物与设计

试验选取10周龄Wistar孕鼠18只(购自扬州大学比较医学中心)，随机分成3组(n=6)，即缺硒组、正常硒对照组和富硒组，统一饲喂无硒基础饲料，并在饮水中分别添加0.03、0.15和1.5 mg/kg的高羊毛氨酸硒。

孕鼠均单独饲养于笼中，环境温度(22±1)℃、湿度(60±5)%，晚上7点至早上7点进行12 h的明暗循环，自由采食、饮水。

1.3 主要试剂

总抗氧化能力(T-AOC)测试盒(货号:A015)，过氧化氢酶(CAT)测试盒(货号:A007-1)，总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(货号:A001-1)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测试盒(货号:A005)和丙二醛(MDA)测试盒(货号:A003-1)均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 试验方法

每只孕鼠自然分娩4 d后，分别选取4只乳鼠，每组共计24只乳鼠，测定新生乳鼠体重后，对其实施安乐死，分离胸腺及脾脏，称重并计算脏器指数。取新生乳鼠的十二指肠及空肠 -20 ℃保存，用于检测组织中T-AOC、GSH-Px、CAT、T-SOD和MDA 。脏器指数=脏器重量/体重。

将取自同只孕鼠分娩的新生乳鼠的十二指肠样本，两两混合成一个样本，每只孕鼠可采集2个乳鼠的混合十二指肠样本，每组共计12个乳鼠十二指肠样本。同样的方法，收集乳鼠空肠样本。取0.1 g左右十二指肠或空肠样品，放入2 mL的离心管，并按1∶9的质量体积比，加入4 ℃生理盐水制成10%组织匀浆，将匀浆以4 ℃，3 500 r/min转速离心10 min，吸上清液，按试剂盒说明书进行抗氧化相关指标的检测。

1.5 统计分析

试验数据经 SPSS Statistics 25.0处理，进行单因素方差ANOVA统计分析。结果以“平均值±标准差”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠体重的影响

由图1可见，分娩后第4天，对每组24只乳鼠，共计72只乳鼠进行体重检测，发现3组间体重差异不显著(P>0.05)。

图1 孕鼠补SeHLan对分娩后第4天乳鼠体重的影响

2.2 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

由图2可见，取出生第4天的乳鼠脾脏和胸腺进行脏器指数检测，缺硒组新生乳鼠的胸腺指数和脾脏指数均极显著低于正常硒对照组(P<0.01)；富硒组新生乳鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著高于正常硒对照组(P<0.05)。

与对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.3 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠十二指肠抗氧化相关指标的影响

由图3、图4可见，与正常硒对照组相比, 缺硒组新生乳鼠十二指肠的CAT、GSH-Px活性和T-AOC均出现显著降低(P<0.05)，且MDA含量极显著升高(P<0.01)；富硒组新生乳鼠十二指肠的GSH-Px和T-AOC活性均显著升高(P<0.05)，CAT活性极显著升高(P<0.01)，且MDA含量显著降低(P<0.05)。各组间T-SOD活性随补硒剂量增加而升高，但差异不显著(P>0.05)。

图3 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠十二指肠抗氧化相关指标的影响

图4 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠十二指肠MDA含量的影响

2.4 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠空肠抗氧化相关指标的影响

由图5和图6可见，与正常硒对照组相比，缺硒组新生乳鼠空肠内的CAT、GSH-Px活性和T-AOC均显著降低(P<0.05)，且MDA含量极显著升高(P<0.01)；富硒组新生乳鼠空肠内的CAT、GSH-Px和T-AOC活性均显著升高(P<0.05)。各组间T-SOD活性随补硒剂量增加而升高，但差异不显著(P>0.05)。

图5 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠空肠抗氧化相关指标的影响

图6 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠空肠MDA含量的影响

3 讨论

3.1 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠体重和脏器指数的影响

硒是机体生长发育所必需的微量营养元素，可通过硒蛋白发挥其功能。妊娠期硒的缺乏会增加包括胎儿生长受限在内的妊娠并发症风险[9]。富硒日粮可改善机体硒的水平，维持母体的生育能力及胎儿的正常发育，减弱妊娠应激造成的不利影响[10]。动物免疫器官是淋巴细胞和其他免疫细胞发育、分化、成熟、增殖并产生免疫反应的地方。研究表明，硒能促进体外培养的小鼠脾细胞增殖以及白细胞介素-4(interleukin 4，IL-4)和γ-干扰素(interferon γ，IFN-γ)的产生，增强细胞免疫和体液免疫[11-13]。Peng等[14]用低硒日粮饲喂雏鸡21 d后，采用流式细胞术检测胸腺细胞周期，发现胸腺细胞G0/G1期阻滞，且细胞凋亡增多，缺硒抑制了胸腺的发育。Fredericks等[15]研究证实，在硒蛋白K缺陷型小鼠中，T细胞增殖减少，中性粒细胞迁移减缓，巨噬细胞表现出过度的氧化应激。胸腺是中枢免疫器官，幼年时逐渐发育，性成熟后逐渐退化；脾脏是外周免疫器官，终生存在。胸腺指数和脾脏指数在一定程度上能反映机体的非特异性免疫状态。王亨等[16]报道，妊娠期补充亚硒酸钠可显著提高新生乳鼠的胸腺指数和脾脏指数。本试验在母鼠妊娠期补充不同剂量的SeHLan，发现SeHLan显著提高胸腺指数和脾脏指数，提示妊娠期母鼠补充的SeHLan能经血液或乳汁作用于新生乳鼠，增强新生乳鼠的非特异性免疫。Meyer等[17]研究发现，妊娠期母羊缺硒会导致新生羔羊体重降低。本试验对新生乳鼠的体重也进行了统计分析，但发现补充SeHLan对新生乳鼠的体重没有显著影响，这可能与鼠的妊娠期短、产仔数多以及种属差异有关。

3.2 孕鼠补SeHLan对新生乳鼠十二指肠及空肠抗氧化能力的影响

肠道不仅是阻止细菌及毒素等有害物质侵入机体的重要屏障，也是产生炎症介质以及调节机体应激反应的重要器官[18]。肠道氧化应激的重要损伤机制是氧自由基水平升高引起DNA损伤、线粒体损伤、蛋白质变性、脂质过氧化、信号转导异常、能量代谢紊乱和肠道细胞凋亡，进而导致肠黏膜结构破坏，影响吸收功能，造成相关疾病[19]。谷胱甘肽过氧化物酶、硒蛋白P和硒蛋白S等在肠道中发挥着重要的氧化还原调节、抗氧化及抗炎作用[20]，促进肠道稳态。新生儿肠道发育不全，生理机能发育不成熟，会显著影响新生儿的营养吸收，导致代谢异常、生长受限，并引发胃肠道疾病[7]。Salman等[21]在奶牛妊娠期与哺乳期添加相同剂量无机硒与有机硒后，发现相比较于无机硒，有机硒更有效地提高了牛乳中的硒水平，且牛初乳中的硒含量最高，而后逐渐降低。本试验结果表明妊娠期的孕鼠补充SeHLan，能提高新生乳鼠十二指肠和空肠的抗氧化能力，减弱其氧化损伤程度。这可能是SeHLan通过胎盘和乳汁作用于新生乳鼠，提高了乳鼠血液和肠道内硒和硒蛋白的含量，增强了乳鼠肠道抵御氧化损伤的能力。本试验中，乳鼠十二指肠和空肠中T-SOD活性随孕鼠补硒剂量的增加而呈升高趋势，但无显著性，这可能与硒不是超氧化物歧化酶的活性中心有关。

综上所述，在本研究中，孕鼠补SeHLan提高了新生乳鼠先天非特性免疫力以及十二指肠和空肠的抗氧化能力。该试验结果表明，妊娠期母畜通过在日粮中添加SeHLan可增强新生动物先天免疫力及肠道抗氧化能力。