富硒萌发对亚麻籽油中脂质伴随物含量的影响

刘晓晨，杨光*，杨波，周盛敏

1(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海，200093)2(丰益(上海)生物技术研发中心有限公司，上海，200137)

硒在自然界中有无机硒与有机硒2种存在形态。无机硒主要包括硒酸盐、亚硒酸盐、单质硒、硒化物等物质[1]，而在植物体内，硒会以硒氨基酸、甲基硒代半胱氨酸等有机硒化合物的形式存在。硒可以充当各种酶的辅助因子，例如，谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，进而可以保护细胞免受自由基和脂过氧化物引发的损害[2]，所以，它可以通过减少H2O2和脂质氢过氧化物来对抗细胞内的氧化应激，从而保护人体免受有害自由基的伤害。硒还充当三碘甲腺氨酸脱碘酶的辅因子，三碘甲腺氨酸脱碘酶是一种参与甲状腺激素代谢的重要酶，可以预防甲状腺肿[3]。

目前，对植物富硒采用亚硒酸钠的方法比较常见，植物吸收亚硒酸钠后，通过与谷胱甘肽的反应，首先形成富硒氧化型谷光甘肽(GS-Se-SG)中间产物，再经过一系列的反应转化为硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸[4]，这个过程是植物将无机硒转化成有机硒的过程。在植物富硒的过程中，亚硒酸钠与谷胱甘肽反应的同时伴随着自由基的产生，这将对植物造成一定的氧化应激压力，这时，植物也可能产生一些次生代谢产物，例如：多酚，来应对这种环境的变化，所以，无论是作为几种关键抗氧化剂的组成成分来减少活性氧代谢物以抵抗氧化应激还是刺激机体的抗氧化系统和苯丙烷代谢等复杂的信号传导途径来增加次生代谢产物的含量，总之，硒具有抵御自由基的作用。此外，众所周知，芽是所有食物中最有营养的食物之一，提供丰富的蛋白质、碳水化合物、纤维、矿物质和维生素，最重要的是，芽也是硒的蓄积剂[5]，可以从不同的无机来源积累硒。本文将亚麻籽在富集不同浓度的亚硒酸钠溶液光照萌发3 d后，冷榨成亚麻籽油,探究硒元素对油中脂质伴随物的含量及抗氧化活性变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚麻籽，产地哈萨克；石油醚(30～60 ℃)、异丙醇、冰醋酸、三氯甲烷、碘化钾、福林酚试剂、二氯甲烷、无水甲醇、无水乙醇、正己烷、无水碳酸钠、异辛烷、硫酸氢钠、乙酸乙酯、无水乙醚、无水硫酸钠、苯乙醇标品、没食子酸标品(纯度≥90 %)，上海国药集团；DPPH、α-生育酚标品、γ-生育酚标品(纯度≥99%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈(色谱纯)、异丙醇(色谱纯)、弗罗里土SPE小柱(1 g/6mL)、亚硒酸钠(纯度≥99%)，上海泰坦科技股份有限公司；硅烷化试剂(纯度≥99%)，上海麦克林生化科技有限公司；β-胆甾烷醇(纯度≥99 %)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；二醇基固相萃取柱(500 mg/3mL)，上海安谱实验科技股份有限公司；环肽混标，暨南大学提供。

1.2 仪器与设备

FX7螺旋压榨机，广州旭众食品机械有限公司；FD115烘箱，上海智鸢机电设备有限公司；1800紫外分光光度计，日本岛津公司；台式高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；全自动脂肪提取仪，美国ANKOM公司；Agilent 7890 配FID检测器和自动进样器、液相色谱仪1200，安捷伦科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 富硒萌发的亚麻籽油的制备

每盘取大约25 g亚麻籽(共20盘，每个浓度下萌发5盘)，挑拣出坏的、不完整的种子，用1%(体积分数)次氯酸钠消毒5 min，冲洗干净，在常温下，分别用0、0.2、1、5 mmol/L的亚硒酸钠溶液浸泡4 h后，在流动的水中反复冲洗3遍，在发芽盘中盛1 000 g水，网盘格上平铺一层湿润纱布，将亚麻籽平铺在纱布上面薄薄的一层，水不没过亚麻籽，放置在(23±3)℃的恒温室内，种子需在植物生长灯(PHILIPS GreenPower TLED DR/W 红光/白光，光照距离：50 cm，光照强度：24 μmol/s)下生长，光周期是黑暗8 h，光照16 h，1 d喷4～5次水，使种子保持湿润，每天重新换水，以防止长菌，在第3天取样，55 ℃烘干，冷压榨出亚麻籽油，6 000 r/min离心6 min，滤纸过滤，贮藏在-18 ℃备用。

1.3.2 理化指标的测定

含油率测定：参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[6]；水分的测定：参照 GB 5009.3—2016《动植物油脂 水分及挥发物的测定》[7]；根长测定：随机选取10根萌发亚麻籽用直尺测量根长；酸价的测定：参照 GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》[8]；过氧化值的测定：参照 GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》[9]；脂肪酸测定：参照 GB 5009.168—2016 《食品中脂肪酸的测定》[10]；反式脂肪酸测定：参照 GB 5009.257—2016 《食品中反式脂肪酸的测定》[11]。

1.3.3 典型脂质伴随物含量的测定

生育酚的测定：参照 GB/T 26635—2011《动植物油脂生育酚及生育三烯酚含量测定高效液相色谱法》[12]；多酚的测定：参照 LST 6119—2017《植物油中多酚的测定》[13]；没食子酸标准曲线：y=0.010 3x+0.021 9，R2=0.999 9。甾醇的测定：参照 NY/T 3111—2017《植物油中的甾醇测定》[14]。类胡萝卜素的测定，参照易志[15]的方法进行测定。

1.3.4 油脂的体外抗氧化活性的测定

采用王屋梁等[16]的方法测定亚麻籽油中的全油DPPH自由基清除能力。

1.3.5 亚麻籽油中环肽的测定

配制溶液：上样液：V(正已烷)∶V(乙醚)=85∶15；洗涤液：V(正已烷)∶V(乙醚)=70∶30；洗脱液：V(异丙醇)∶V(甲醇)=60∶40。

称取1.0 g的毛亚麻籽油样品，加入5 mL的上样液溶解为样品溶液。取一支弗罗里土SPE小柱(1 g/6mL)，先用上样液洗涤2次并完全浸润。在吸取全部样品溶液后，注入硅胶SPE小柱，弃去流出液，重复2次，最后吸取8 mL的洗脱液洗脱SPE小柱，并收集流出液于10 mL的容量瓶内，吹干，用异丙醇定容，最后将样品溶液用0.45 μm的尼龙滤膜过滤后，上液相色谱检测。

色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm), 配置双元泵和自动进样器。两通连接，柱温35 ℃,柱压：103 Pa,进样体积为 20 μL，流动相分别为乙腈和水，梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC洗脱梯度Table 1 HPLC gradient elution

1.3.6 数据统计分析

本实验所有指标均设3组重复，采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，用 Duncan 法对结果进行显著性分析，P<0.05 时表示存在显著性差异，运用 Origin 8.5 软件作图，数据结果均以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 亚麻籽中根长、含水率、含油率的变化

为研究不同浓度亚硒酸钠溶液对萌发亚麻籽的根长、含油率，含水率的影响，进行光照萌发处理，由表2可以看出，低浓度的硒溶液会促进亚麻籽根长的伸长，而高浓度的硒溶液会抑制亚麻籽根长的伸长，推测原因是：在种子萌发初始阶段——吸涨阶段，硒酸盐通过种皮和糊粉层进入种子内部，并通过种子间隙渗入胚乳和胚的细胞，被亚麻籽吸收利用，但过高浓度硒化合物有细胞毒性，并表现出剂量高度相关的生物毒性反应。所以，高浓度的硒溶液浸泡会抑制根的伸长[17]，适当的硒溶液会稍微促进亚麻籽的吸水，但对种子中的含油率没有显著性影响。

表2 亚麻籽中的根长、含水率、含油率Table 2 The moisture, crude fat and length of flaxseed

2.2 亚麻籽油中酸价、过氧化值的变化

酸价、过氧化值是评价油脂的重要指标。从表3中可以看出，随着硒溶液浓度的增加，酸价呈现是先升高后降低的趋势，与GUARDADO-FÉLIX等[18]研究富硒鹰嘴豆油的趋势一致，未富硒的亚麻籽油酸价为6.63 mg KOH/g，在0.2 mmol/L时，增加到7.75 mg KOH/g，该指标与游离脂肪酸含量有关，油中酸价的增加表明甘油三酯的水解，这是由于脂肪酶A1和A2活性的增加，这些酶的合成可为幼苗发育提供能量[19]，此外，油中的过氧化值则是呈现持续上升的趋势。

表3 亚麻籽油中的酸价、过氧化值Table 3 The acid value、peroxide value of flaxseed oil

2.3 亚麻籽油中脂肪酸、反式脂肪酸的变化

为研究不同浓度的亚硒酸钠溶液处理对萌发的亚麻籽油中的脂肪酸、反式脂肪酸变化的影响，进行气相色谱分析，从表4中可以看出，脂肪酸谱显示出大量的不饱和脂肪酸，主要是亚麻酸，其次是油酸和亚油酸，并且不同浓度的硒溶液不会对亚麻籽油中的脂肪酸的种类和含量、反式脂肪酸产生影响，该结果与BUSINELLI等[20]研究富硒初榨橄榄油的结果一致。

表4 亚麻籽油中脂肪酸、反式脂肪酸含量 单位：%

2.4 亚麻籽油中多酚含量的变化

植物酚类化合物在形成的过程中，赤鲜糖-4-磷酸与磷酸烯醇丙酮酸结合形成苯丙氨酸。苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸转化为反式肉桂酸和其他一些酚类化合物，如黄酮类、香豆素类、可水解单宁、单甘醇和木脂素[21]。

从图1中可以看出富硒萌发会促进亚麻籽油中多酚含量的增加，添加浓度为0.2 mmol/L时差异显著，多酚含量增加了约为20.69 mg/kg，与未富硒的亚麻籽油相比增加了约为56.37%，但随着硒溶液浓度的增大，多酚含量却没有明显增加，可见0.2 mmol/L为最佳富硒浓度，GUARDADO-FÉLIX等[18]在研究硒对发芽的鹰嘴豆影响时发现，与不含硒萌发的鹰嘴豆油相比，含硒萌发的鹰嘴豆油中的酚类物质增加了36%。BUSINELLI等[20]同样也发现，用含硒肥料进行施肥要比不含硒的多酚含量更高一些，而且该研究也证实了硒在减轻干旱胁迫条件下的危害方面具有积极作用。

图1 亚麻籽油中的多酚含量Fig.1 Polyphenol content of flaxseed oil注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)

2.5 亚麻籽油中类胡萝卜素含量的变化

类胡萝卜素是四萜类化合物，其特征是具有离域π电子的双键共轭系统。由于极度疏水，这些化合物通常存在于膜或其他疏水部位，在这些部位，其被认为起到抗氧化剂的作用，并在保护组织免受光和氧损伤等方面发挥特殊作用[24]。

种子中含有丰富的类胡萝卜素，是良好的维生素A的来源，种子萌发可以很好的富集类胡萝卜素，但类胡萝卜素的摄入并不等于吸收。人体对蔬菜中的类胡萝卜素的吸收率变化很大(2%～50%)[25]。当单纯摄入蔬菜时，类胡萝卜素的吸收率很差。因为类胡萝卜素是脂溶性维生素，所以，食用油可对类胡萝卜素的吸收起到显著的协同促进作用。

从图2中可以看出，富硒萌发的亚麻籽油可以显著增加类胡萝卜素含量，与未富硒的亚麻籽油相比，在浓度为0.2 mmol/L的富硒萌发亚麻籽油中，类胡萝卜素含量达到了128.78 mg/kg，与未富硒相比，增加约36 mg/kg，但随着硒浓度的增加，类胡萝卜素的含量有所下降，说明，低浓度硒溶液会促进亚麻籽油中类胡萝卜含量的升高。总之，光照萌发与富硒会共同促进亚麻油中类胡萝卜素生成。BUSINELLI等[20]也发现，富硒橄榄油中的叶绿素、类胡萝卜素含量都有所增加。原因可能为硒处理橄榄树会增加橄榄树的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，进而有效清除ROS，避免类胡萝卜素等色素被破坏[26]。

图2 亚麻籽油中的类胡萝卜素含量Fig.2 Carotenoids content of flaxseed oil

2.6 亚麻籽油中生育酚含量的变化

生育酚是天然抗氧化剂，生育酚在一定程度上可以使α-亚麻酸和亚麻籽油中的自由基转变为非活性或较为稳定的化合物，终止自动氧化反应，使油脂的氧化减少，同时也是一种强有效的自由基清除剂，具有延缓衰老和抗氧化的作用[27]。此外，α-生育酚可以对植物中的抗氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶起到促进作用。硒(作为谷胱甘肽过氧化物酶的辅助因子)和生育酚在功能上与其他营养抗氧化剂(如抗坏血酸、类胡萝卜素和含硫氨基酸)相互促进，以保护细胞免受ROS的影响[28]。

从图3中可以看出，随着硒溶液浓度的增加，α-生育酚浓度、总生育酚含量呈现先上升后下降的趋势，因为生育酚和硒都具有抗氧化作用，在一定条件下，生育酚可替代部分硒的作用，硒对植物体具有节省生育酚的效能，但不能完全替代生育酚。根据实验结果得出，硒与生育酚只是在功能上协同促进，但硒并不能促进生育酚的合成[29]。PEDRERO等[30]也发现类似的现象，植物中的α-生育酚含量随着硒添加量的增加而增加，并且当植物在富含镉的培养基上生长时，叶片中的总生育酚含量会降低，但是在硒同时加入时，可以抵消40%生育酚含量的减少。

图3 亚麻籽油中的α-生育酚、γ-生育酚及总生育酚Fig.3 Changes in tocopherol compositions (α-, γ- and total tocopherol) of flaxseed oil

2.7 亚麻籽油中环肽相对含量的变化

亚麻环肽含有8、9或10个氨基酸残基，环肽是一类存在于多个植物家族中的环状肽，具有缺乏二硫键交联的N—C连接环状结构[31]。亚麻环肽目前有20种，其有共同氨基酸序列，且会随蛋氨酸残基的氧化其而变化，因为蛋氨酸(Met)可以氧化为蛋氨酸S-氧化物(MetO)，而蛋氨酸S-氧化物可以进一步氧化为蛋氨酸S，S-二氧化物(MetO2)。

在新鲜的亚麻籽中，还原型Met亚麻环肽含量较高(环肽A)，这类环肽在贮藏和加工条件下很容易被氧化，比如，经过萌发后含量会急剧降低，环肽E则是Met的氧化产物MetO，含量会有所上升，环肽F、G、M则是MetO2，这些含MetO2的肽具有比Met和MetO亲本更高的热稳定性和化学稳定性[32]。

以0.01 μL/mL苯乙醇为内标物，为了显示趋势，同时扩大了100 000倍，进行相对定量分析，从图4中可以看出，环肽E是随着硒溶液浓度的增加而增加，环肽A随着硒溶液浓度增加而降低，浓度为0.2、1 mmol/L的富硒亚麻籽油中环肽B含量稍有降低，5 mmol/L的富硒亚麻籽油环肽G、M含量稍有升高。说明，硒溶液处理可能会加速氧化亚麻籽油，形成更加稳定的环肽MetO、MetO2。

图4 亚麻籽油中的环肽相对含量Fig.4 Relative content of cyclic peptides in flaxseed oil

2.8 亚麻籽油中DPPH自由基清除率的变化

硒在饮食中是必需的微量元素，其与Cys和Met结合形成硒代半胱氨酸和硒蛋氨酸，硒代蛋氨酸与蛋白质结合形成硒蛋白。硒蛋白包括谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶等抗氧化酶，这些酶可以提高种子的抗氧化性[33]。此外，LI等[33]发现，与普通糙米相比，硒化糙米芽在不同温度下贮藏9个月，可以保持较高的品质和氧化稳定性,这种显著差异归因于硒的抗氧化活性及其对脂质过氧化的抑制作用。

从图5中可以看出，富硒萌发的亚麻籽油能够增加亚麻籽油的抗氧化性，而且在硒浓度为0.2、1 mmol/L时，抗氧化性优于未富硒亚麻籽油，与未富硒的亚麻籽油相比，硒浓度为0.2 mmol/L时，抗氧化性增加15.44%，可见富集低浓度的硒可以提高亚麻籽油的抗氧化作用。GUARDADO-FÉLIX等[34]发现，与不含亚硒酸钠的鹰嘴豆芽菜相比，含硒的抗氧化能力提高了26%。

图5 亚麻籽油的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rate of flaxseed oil

总体来说，富硒可以增加亚麻籽油中的有益脂质伴随物含量，但同时也会导致亚麻籽油发生一定程度氧化酸败，油脂后续步骤中的负压精炼，不仅可以降低油中酸价，还可以进一步缓解有益脂质伴随物在油中的损失，以及缩短精炼的时间等都具有一定缓解多酚等脂质伴随物质的损失[35]。总之，整体来看，富硒处理亚麻籽油是利大于弊的。

3 结论

富硒对萌发亚麻籽油中脂质伴随物的含量有一定影响，最佳的处理硒浓度为0.2 mmol/L，多酚含量增加20.69 mg/kg，相应的抗氧化活性增加15.44%，类胡萝卜素含量大幅度增加，达到128.78 mg/kg，α-生育酚含量达到637.3 mg/kg，硒与生育酚在功能上具有协同促进作用。综上，低浓度的硒溶液处理可以提高亚麻籽油中脂质伴随物含量。