兔骨折血肿细胞分离回植对骨折愈合的影响及机制的研究

马震卓 郝 鑫 石光耀 张 霖 于淑红 申国强 蔡成坤 张 新

对骨折愈合的研究随着分子生物学技术的发展，已经从细胞生物学水平深化到分子生物学水平［1-3］。研究者［3-6］发现，在骨折血肿细胞中存在各种生长因子，包括血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、转 化 生 长 因 子‑β（transforming growth factor‑β，TGF‑β）、血管内皮生长 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及骨保护素（osteoprotegerin，OPG）等。尽管各种生长因子在骨组织及血肿细胞中含量较少，但在骨折愈合过程的不同时期中，对调节骨细胞分裂、细胞黏附、细胞增殖、细胞迁移、细胞外基质合成及组织分化等起着不可替代的作用［7-10］。

方 法

1.实验动物

选取雄性新西兰大白兔36只（北华大学中心实验室提供），体重2.5~3 kg，兔龄7~8个月。平均分成实验组和对照组，每组18只动物。

2.骨折模型制备和分组处理

用25%乌拉坦麻醉剂对实验兔进行麻醉，按4 ml/kg经耳缘静脉缓慢推注，麻醉后固定于手术台上，对实验兔右下肢股骨髁上下5 cm范围进行剪毛处理，局部碘伏消毒3遍，股骨髁上部周围注射盐酸利多卡因浸润麻醉，用外骨折器在股骨髁上制作闭合骨折模型［7，11］。骨折兔放置2 h后，无菌操作，切开皮肤肌肉，分组进行相应处理。

实验组：快速收集骨折断端周围血肿细胞液，无菌条件下制备并分离骨折血肿细胞，对骨折断端行钢针内固定。将可吸收性明胶海绵吸附分离后的血肿细胞液，放置于骨折断端，使其缓慢释放。对照组：按常规方法去除骨折断端周围血肿细胞液后行钢针内固定。分别于术后第10、20、30天，每组各随机选取6只动物处死，取材后进行影像学和组织学观察。

3.X线检查

观察股骨髁骨折处骨痂形成数量，骨质密度情况。影像学评分标准：①0分，骨折断端边缘清晰，无骨膜反应；②1分，骨折断端边缘较模糊，轻微骨膜反应；③2分，骨折边缘模糊，骨膜反应浅、少量骨痂、密度淡；④3分，骨折断端接近消失，骨膜反应深、骨痂增多、密度深；⑤4分，骨折断端边缘完全消失，骨膜反应近似骨影、骨痂充满缺损区、密度与骨皮质相同。

4.组织学观察

在无菌条件下取骨，将股骨干周围软组织清除干净，在距股骨髁骨折处两端1 cm处整齐锯下标本骨，将其放入10%中性甲醛溶液中，固定12 h后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，再加入10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液中脱钙5周后，经脱水-透明-浸蜡-包埋备用。

4.1 HE染色及观察

制作石蜡切片，以5 mm厚度为标准。经脱蜡-水化-苏木精染色-盐酸酒精分化-伊红染色-脱水透明，最后中性树胶封片。光镜下观察HE染色切片，观察骨痂生长的组织形态，以及HE染色骨组织切片中成骨细胞的数量。

4.2 免疫组织化学染色（SP法）

将标本分组，分别滴加蒸馏水稀释后，加入1︰300的PDGF抗体、TGF‑β抗体作为一抗。放置于4℃冰箱过夜12 h，在标本中分别滴加SP（链霉亲和素‑过氧化物酶），滴加已经先配制的二氨基联苯胺（DAB）显色溶液显色，放入苏木精溶液中复染。在显微镜下镜检观察，同时记录数据，照相、存盘。

5.统计学分析

采用spss19.0软件进行数据处理和分析。计量资料以均数±标准差表示，符合正态分布者采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.一般情况

2组实验兔术后1周进食恢复正常，活动恢复正常，切口无感染。术侧肢体可自然活动。

2.X线表现

术后第10天，2组实验兔均无明显骨痂形成，实验组骨折断端轻度模糊征象。术后第20天，对照组骨折断端边缘模糊，多数均无明显骨痂形成；实验组骨折断端见有少量骨痂形成，骨痂的密度低于正常的骨质的密度。术后第30天，对照组与实验组骨折断端均有骨痂出现，且骨痂密度均高于术后第20天，实验组骨痂量明显高于对照组，少数对照组骨折断端局部可见低密度骨折线。2组影像学评分详见表1。

表1 实验组与对照组术后不同时间影像学评分

3.HE染色结果

实验兔术后不同时间骨折断端标本HE染色结果见图1。对HE染色切片中的细胞进行计数，结果（表2）显示，术后第10、20、30天，实验组中的成骨细胞数量均多于对照组。

表2 实验组与对照组成骨细胞数量对比

图1 实验组和对照组术后不同时间骨折断端标本HE染色结果

4.免疫组织化学染色结果

4.1 PDGF在骨组织中的表达

实验兔术后不同时间骨组织PDGF免疫组织化学染色结果见图2。术后第10天，实验组成骨细胞免疫表达弱阳性；对照组无阳性表达，仅见骨细胞存在。术后第20天，实验组成骨细胞免疫表达为强阳性；对照组免疫弱阳性表达。术后第30天，实验组骨细胞免疫表达强阳性，与术后第20天的表达强度相仿；对照组弱阳性表达。实验兔术后不同时间骨组织PDGF表达强度详见表3。

图2 实验组与对照组骨组织PDGF的表达（×40）

表3 骨折愈合不同时间成骨细胞PDGF的表达

4.2 TGF-β在骨组织中的表达

实验兔术后不同时间骨组织TGF‑β免疫组织化学染色结果见图3。术后第10天，实验组在骨组织骨小梁周围见少量颜色较浅淡的棕黄色颗粒，为成骨细胞TGF‑β的弱阳性表达；对照组没有阳性表达，仅见骨细胞存在。术后第20天，实验组骨组织骨小梁周围见密集排列的成骨细胞，其颜色为深棕黄色颗粒改变，TGF‑β呈强阳性表达；对照组仍没有阳性表达。术后第30天，实验组骨组织骨小梁周围成骨细胞数量减少，TGF‑β表达强度有所降低，但仍比术后第10天强；对照组骨组织周围见少量浅淡的棕黄色颗粒，呈弱阳性表达。实验兔术后不同时间骨组织TGF‑β表达强度详见表4。

表4 骨折愈合不同时间成骨细胞TGF⁃β的表达

图3 实验组与对照组骨组织TGF‑β的表达（×40）

讨 论

骨折血肿能够促进骨折愈合已经被人们所认知，国内外已经有大量的实验及病例报道［12-15］，骨折血肿在增加骨痂形成数量、加速骨痂形成、缩短骨折愈合时间方面有着显著的促进作用［16］。

骨折愈合是复杂的修复再生过程，主要包括早期的损伤反应期，中期的膜内化成骨期、软骨形成期和晚期的软骨内化骨。机体出现骨折后，骨折断端及周围软组织形成血肿，血肿细胞内富含多种生长因子及大量炎性细胞，促进骨折伤口愈合的同时清除坏死的炎性组织，为骨折愈合全过程起到良好的开始作用［17-20］。本研究结果提示，骨折血肿分离细胞回植后，骨组织表达的细胞因子在骨折愈合的不同时期发挥着重要作用。

本实验结果表明，骨折血肿分离细胞回植后，骨折愈合无明显感染及排斥反应，提示其可促进骨折愈合。在HE染色切片任选视野下观察，可见成骨细胞规则排列在骨组织表面，呈棕黄色强阳性表达。在骨折愈合不同时期，成骨细胞数量有所不同。X线片骨折断端骨痂定量分析证实，实验组较对照组骨痂形成时间短，数量多。通过测定骨折愈合不同时间骨组织PDGF和TGF‑β的表达，证实促进骨折愈合的分子机制可能部分与其中PDGF及TGF‑β的表达增强有关。

骨折早期，PDGF表达逐渐增强，促进成骨细胞DNA合成，加速其复制潜能，诱导软骨细胞分化为成骨细胞，以促进纤维骨痂的形成。骨折晚期，在骨折断端骨痂形成较多，骨痂塑形开始，骨折处骨细胞的吸收与破坏是同时进行的，此时PDGF呈强阳性表达，同样说明其加速骨折愈合，发挥双向调节骨折愈合的作用。从分子水平上研究骨折修复的机制，已成为骨折愈合修复的前沿研究方向，将有助于骨折治疗研究的开展及新策略的制订，并指导临床工作中对骨折后早期血肿处理，最终对促进骨折愈合、防止延迟愈合或不愈合等并发症有重要意义。