美洲大蠊提取物对精神疾病患者肠道菌群影响的研究

尹春蕾，王 楠，马莹莹，贾乘一，张 倩，李丽娟

（1.大理大学公共卫生学院，云南大理 671000；2.大理大学澜湄人类健康研究中心，云南大理 671000）

美洲大蠊Periplaneta americana（L.），俗称蟑螂，其提取物具有抗肿瘤、增强免疫、保肝、促进组织修复，如血管再生和创面愈合等药理作用〔1-2〕。有实验表明美洲大蠊对小鼠的腹泻有抑制作用〔3〕，提示美洲大蠊可能对小鼠的肠道菌群起到改善作用。人类肠道菌群中存在着大量的微生物和寄生虫，健康的菌群环境有利于维持机体功能的正常运转〔4〕。2008年Romijn等〔5〕提出脑-肠轴这一双向调节轴概念，并有研究证明脑-肠轴的功能紊乱对人类的健康会产生很大的影响，对于精神疾病患者，脑-肠轴调节在其病程中发挥着一定的作用〔6〕。本文以精神疾病患者为研究对象，通过观察美洲大蠊提取物对精神疾病患者发作期与控制期肠道菌群影响的差异，探索美洲大蠊提取物对其肠道菌群环境是否有影响，对美洲大蠊可能的适应证领域进行初步探索。

1 材料和方法

1.1 药品美洲大蠊提取物为云南省昆虫生物医药研发重点实验室自制，批号编号：PKA，棕褐色液体，-20 ℃保存。

1.2 试剂与仪器大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）；肉膏酵母葡萄糖琼脂培养基；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA，含氯霉素）；磷酸盐缓冲液（PBS）等。超净工作台；电子天平；分析天平；恒温培养箱；快速全自动高压蒸汽灭菌器；厌氧培养系统；低温冰箱（BCD-226ST C,海尔公司）；培养皿；三角瓶；酒精灯；pH试纸；立式超低温保存箱（DW-86L386,海尔公司）。

1.3 方法

1.3.1 采样 2018年6月至8月在大理州第二人民医院选取19例新住院的精神疾病患者作为研究对象，包括精神分裂症（schizophrenia，SCH）和双相情感障碍（bipolar affective disorder，BPD）两类患者。纳入标准：患者符合《精神障碍诊断与统计手册》（第5版）〔7〕SCH和BPD诊断标准，由两名精神科医生共同认定确诊，且入院1个月前均无用药史。排除标准：合并高血压、糖尿病、心脏病、胃肠道疾病等其他系统性疾病。对患者发作期和控制期的粪便分别进行采样，其中将发作期的样本分为空白组和实验组（向样本中加入美洲大蠊提取物），控制期为阳性组（临床用药）。

1.3.2 微生物共培养 用灭菌棉签取200 mg新鲜粪便于EP管中，加入1.8 mL灭菌的PBS，立即将EP管封口，在振荡器上振荡5 min，使粪便均质化，此为初始浓度储备液。在初始浓度储备液里吸取200 μL溶液，放入含有1.8 mL灭菌的PBS的EP管中，振荡均匀，此为10-1浓度溶液。依次类推，按同样的稀释方法将上述振荡好的标本进行10 倍稀释至10-8浓度溶液。根据预实验的结果，选择3~4个适合的稀释度，分别取100 μL于各选择性培养基上，用简单涂板法均匀涂布后培养，每个稀释度均设3个重复。待菌落长出后，以菌落形态、生化反应鉴定所需目的菌，对各培养基上的菌落数量进行计数。培养条件及鉴定方法见表1。

表1 3类微生物的培养条件及菌落计数方法

1.3.3 菌落计数 培养好的菌落经鉴定后计算粪便中菌落数量（CFU/g）。需氧菌、厌氧菌的培养选择菌落数范围在30~300个菌落的平板进行计数，真菌的培养选择菌落数范围在10~150个菌落的平板进行计数。选择在菌落数范围内的稀释度溶液进行菌落计数，按下式计算出同一稀释度溶液的平均菌落数（X）。标本菌落数量（CFU/g）=（10X×稀释倍数）/标本质量（g）。结果用lg（CFU/g）表示。

1.4 统计学分析采用 SPSS 23.0 和 Excel 2003 进行统计学分析，各检测数据计量资料用表示。各组数据比较依据资料的性质，对符合正态方差齐的数据进行方差分析，对不符合正态方差齐的数据进行秩和检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌落计数

2.1.1 不考虑人口特征对菌落计数的影响 在不考虑人口特征的情况下，需氧菌空白组的菌落数为（8.39±1.06） CFU/g，实验组的菌落数为（10.18±0.80）CFU/g，阳性组的菌落数为（9.77±0.76）CFU/g；厌氧菌空白组的菌落数为（8.83±0.86）CFU/g，实验组的菌落数为（10.62±0.39）CFU/g，阳性组的菌落数为（10.30±0.38）CFU/g；真菌空白组的菌落数为（4.41±0.92）CFU/g，实验组的菌落数为（6.48±0.80）CFU/g，阳性组的菌落数为（6.16±0.80）CFU/g。

2.1.2 不同人口特征对菌落计数的影响 按照性别、疾病分期和疾病类型将19例患者进行分类，对需氧菌、厌氧菌和真菌的不同组别分别计数。菌落计数结果见表2。

表2 不同人口特征分组中菌落计数结果（）

表2 不同人口特征分组中菌落计数结果（）

分组性别 疾病分期 疾病类型男性（n=14） 女性（n=5） 首发（n=10） 再发（n=9） BPD（n=10） SCH（n=9）需氧菌空白组 8.30±0.91 8.66±1.50 8.60±0.90 8.17±1.23 8.59±1.15 8.04±1.10需氧菌实验组 10.04±0.82 10.57±0.62 10.22±0.64 10.14±0.98 10.34±0.72 9.92±1.06需氧菌阳性组 9.66±0.79 10.10±0.61 9.88±0.64 9.65±0.89 9.91±0.66 9.50±1.02厌氧菌空白组 8.97±0.79 8.46±1.01 8.87±0.75 8.79±1.01 8.95±0.86 8.85±0.86厌氧菌实验组 9.89±1.08 10.60±0.38 10.62±0.32 10.63±0.47 10.69±0.28 10.46±0.45厌氧菌阳性组 10.63±0.41 10.44±0.36 10.26±0.37 10.34±0.39 10.32±0.38 10.24±0.44真菌空白组 4.61±0.91 3.83±0.75 4.14±0.76 4.70±1.04 4.41±0.98 4.45±0.96真菌实验组 6.59±0.83 6.16±0.67 6.45±0.46 6.51±1.09 6.60±0.63 6.56±1.00真菌阳性组 6.23±0.86 5.98±0.66 6.06±0.63 6.28±0.98 6.29±0.54 6.17±1.12

2.2 3类微生物样本菌落数两两比较差异在不考虑人口特征分组的情况下，3类菌群的3组样本菌落数差异均有统计学意义（F需氧菌=21.463，F厌氧菌=38.803，F真菌=33.384；P均为0.000）。对各类菌群的3组样本菌落数差异进行两两比较，3类菌群空白组与实验组，空白组与阳性组的菌落数差异均有统计学意义（P均为0.000）；需氧菌实验组与阳性组菌落数差异无统计学意义（P=0.478），厌氧菌实验组与阳性组菌落数差异无统计学意义（P= 0.267），真菌实验组与阳性组菌落数差异无统计学意义（P= 0.767）。

在考虑性别、疾病分期和疾病类型人口特征分组下，3类菌群的3种样本菌落数差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3。进一步对各样本菌落数的两两比较显示3类菌群空白组与实验组、空白组与阳性组（除女性和SCH特征的需氧菌组）的菌落数差异均有统计学意义（P<0.05）；实验组与阳性组的菌落数差异均无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表3 3类菌群的3种样本菌落数在不同人口特征下的差异分析

表4 3类菌群的3种样本在不同人口特征分组下两两比较的差异分析

3 讨论

3.1 实验结果分析由实验结果可知3类菌群的3种样本在不分组和分组情况下其空白组与实验组、空白组与阳性组的绝大部分菌落数差异均有统计学意义（P<0.05），实验组与阳性组的菌落数差异均无统计学意义（P>0.05），可认为美洲大蠊提取物对病患肠道菌群有明显的影响。由表4可知，女性和SCH特征中需氧菌空白组和阳性组的菌落数差异无统计学意义（P>0.05），这可能与病患治疗过程中的用药剂量、实验中实验组的药物剂量有所不同和用药时长不同有关。

3.2 脑-肠轴双向调节目前在精神疾病的发病机制研究中更多的学者偏向肠道菌群对精神疾病的影响。有研究表明肠道菌群可以通过脑-肠轴这一双相调节轴对精神疾病进行调控，当其失调时会影响神经系统和免疫系统的发育进而造成多种精神疾病的发生〔7-8〕。

由实验结果可知空白组、实验组与阳性组分别对比后体现的统计学差异说明美洲大蠊提取物对精神疾病患者的肠道菌群起到了调节的作用，而且精神疾病患者本身症状的缓解也会使其肠道菌群结构发生改变。这个结果在一定程度上验证了精神疾病患者的脑-肠轴的互相调节功能〔9〕。合理解释了抗精神病药物治疗后会对患者的肠道微生物菌群种类和数量发生改变的现象〔10〕。

3.3 药理作用和疾病治疗精神药物的使用会造成患者白细胞计数异常、流涎、高泌乳素血症、体温调节障碍以及胃肠功能失调等副作用〔11〕。从庄红艳等〔12〕对精神药物不良反应的调查分析中可知消化系统的不良反应最常见。有实验证明美洲大蠊提取物对小鼠的免疫功能有修复作用，并且不会损伤其正常的免疫功能〔13〕。根据美洲大蠊提取物具有调节免疫的药理作用、免疫异常是SCH的病因假说之一、脑-肠轴双向调控这三点依据，可以推测：在这两类精神疾病治疗中，使用美洲大蠊提取物来源的相关药物和常规治疗药物联合使用，可以通过改善人体的免疫功能和肠道菌群的状态来治疗精神疾病，同时改善患者的消化系统不良反应。

本文仅为美洲大蠊提取物对精神疾病患者肠道菌群的影响进行初探，是对肠道菌群的整体研究，其具体作用及调控机制尚不清楚，有待下一步研究说明。