叶黄素纳米结构脂质载体的制备与表征

孙清瑞，申哲伟，李晶，赵雪龙，郝冬雪

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆 163319）

叶黄素是一种重要的具有多种生理活性的含氧类胡萝卜素，其具有降低多种慢性疾病的发病风险的功效。其生理活性主要有防治因老年黄斑变性病引起的视力下降与失明、抗氧化、抗癌、抗诱变、延缓动脉硬化等作用[1-4]。因其分子含18 个碳原子的共轭长链和位于两侧的两个不同的紫罗酮环，叶黄素易受光、热、氧及加工条件的影响而降解，此外，其还具有水分散性差和生物利用度低的缺陷，从而限制了其应用范围[3]。

近年来，纳米结构脂质载体（Nanostructured Lipid Carriers，NLC）作为一种包埋食品功能成分的技术，已引起越来越多的关注[5-9]。作为在固体脂质纳米粒基础上发展而来的新一代载运技术，纳米结构脂质载体是以液体脂质部分地取代固体脂质，这样其固体脂质中大量的无序晶格可更多地容纳生物活性物质[10-12]。NLC 技术具有生物相容性好、生物利用度高、物理稳定性高、良好缓释特性及易于规模化生产的优点[8]，从而该技术在载运功能性食品成分方面极具应用前景。目前，食品领域的纳米结构脂质载体相关文献报道主要集中在运载β-胡萝卜素、DHA、辅酶Q10、姜黄素、虾青素、番茄红素。这些被脂质包埋的活性成分都具有生物利用度较低，水分散性及稳定性较差的共同特点。通过纳米结构脂质载体技术可提高这些活性成分的生物利用度、水分散性及理化稳定性。因此，研究通过叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）包埋技术的研究，以期提高叶黄素的水分散性和生物利用度。

目前，国内尚未见有关叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）的报道。研究旨在为L-NLC 工业化生产提供前期的理论和技术参考，这对拓宽叶黄素在功能性食品等领域的应用具有十分重要的意义。

1 材料与设备

1.1 主要材料与试剂

叶黄素原料（纯度92%），华北制药股份有限公司；叶黄素标品（货号X6250），Sigma-Aldrich 公司；分析纯试剂正己烷、无水乙醇、丙酮、化学纯试剂吐温80，国药集团化学试剂有限公司；山嵛酸甘油酯（ATO），嘉法狮有限公司；辛癸酸甘三酯（MCT），上海通用药业有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Zetasizer Nano-ZS90 型激光粒度仪，英国Malvern 公司；Dimension Icon 型扫描探针显微镜（AFM），美国Bruker 公司；D8 型X-射线衍射仪（XRD），Bruker AXS（德国）有限公司；IS10 型傅立叶变换红外光谱仪，Nicolet（美国）公司；LabRAM HR Evolution 型共聚焦显微拉曼光谱仪，Horiba Jobin Yvon（法国）公司；UV765 型紫外-可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

DF-101S 型集热磁力搅拌器，常州金坛良友仪器有限公司；TGL-16M 型离心机，湘仪离心机仪器有限公司；Alpha 1-2 LD plus 型冷冻干燥机，德国CHRIT 公司；FS450N 超声波细胞破碎仪：上海生析超声仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 叶黄素纳米结构脂质载体的制备

在预试验的基础上，叶黄素纳米结构脂质载体的制备采用溶剂扩散-超声分散联用法：首先，在回流装置中，于磁力搅拌条件下，基于100 mL 质量分数为2%的吐温80 水溶液，将一定量的固体脂质ATO、叶黄素、液体脂质MCT 及5 mL 无水乙醇加热回流（75 ℃，10 min），使其呈均一相；然后，快速加入100 mL 同温的质量浓度为2%的吐温80 水溶液，磁力搅拌（200 r·min-1）5 min，再经超声分散（超声功率350 W，脉冲为每运行20 s 间歇5 s）5 min；最后，用冰水浴将其迅速冷却至室温，得到L-NLC 溶液，置于冰箱（4 ℃），备测。

2.2 包封率、有效载量的测定

叶黄素总含量的测定采用丙酮增溶法[13-14]。取适量叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）放入10 mL 刻度试管中，加入1 mL 丙酮，漩涡震荡1 min，用丙酮定容至10 mL。同法以空白-NLC 为对照，用紫外-可见光分光光度计测定其波长440 nm 下的吸光值并计算叶黄素含量。叶黄素含量测定的标准曲线方程为y=0.229 73 x-0.032 67。其中，y 为吸光值；x 为试样的浓度，μg·mL-1；线性范围为0.5～4.5 μg·mL-1，R2=0.996 89。同条件下试样平行测定3 次，取其算数平均值。

游离叶黄素的测定采用改进的有机溶剂萃取法[14-15]。取适量L-NLC 放入15 mL 刻度试管中，加入1 mL 正己烷，漩涡震荡1 min，离心（5 000 r·min-1）2 min，取上层正己烷萃取液。重复萃取2 次，合并正己烷萃取液，再用正己烷定容至10 mL。用紫外—可见分光光度法测游离叶黄素含量。标准曲线方程为y=0.254 57 x+0.008 71，其中，y 为440 nm 处吸光值；x为试样的浓度，μg·mL-1；线性范围为0.5～4.5 μg·mL-1，R2=0.996 05。同条件下的试样平行测定3 次，取其算数平均值。

包封率、载量及有效载量分别按公式（1）、（2）和（3）计算。

2.3 粒径的测定

首先，用去离子水稀释叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）试样至适当倍数。接着将稀释后的试样置于聚苯乙烯比色皿（折光指数1.33）中，在（25±0.1）℃恒温3 min，用配有He/Ne 激光器（λ=633 nm）的Nano-ZS90 粒径分析仪测定粒径（散射角为90 °），记录平均粒径和多分散指数PDI 值。PDI 数值越小，表明粒径分布越集中，数值在0～0.3 之间表明具有较好的分散均匀性[16]。

2.4 叶黄素纳米结构脂质载体的表征

表征叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）微观结构时所用的原子力显微镜（AFM）、X-射线衍射仪（XRD）、红外光谱仪（IR）及拉曼光谱仪的分析操作采用文献[14]的方法，具体方法如下：

原子力显微镜（AFM）：首先将适量L-NLC 用超纯水稀释2 000 倍，随后取1 μL 样品在新解离的云母表面铺展，接着将其于室温下放置30 min，使LNLC 颗粒充分吸附于云母表面。待样品室温干燥24 h 后，将其置于原子力显微镜的扫描探头（Si 探针）下，以ScanAsyst 模式扫描（频率320 kHz，弹簧系数42 N·m-1），进行检测。图像采集采用高度模式，设置参数如下：0.977 Hz 扫描速率，512×512 分辨率，5 μm×5 μm 扫描尺寸。图像处理采用NanoScopeTM 软件。

X-射线衍射（XRD）：L-NLC 及空白-NLC 冻干粉的晶相用D8 X-射线衍射仪分析，辐射源为Cu Kɑ，管电压为45 kV，管电流为40 mA，扫描范围为0 °～40 °，扫描速率为2 °·min-1。

红外光谱（IR）：L-NLC 及空白-NLC 冻干粉的IR 谱图采用IS10 傅立叶变换红外光谱仪（美国，Nicolet 公司）测试，测试分辨率为2 cm-1，扫描次数为36 次，测试范围为400～4 000 cm-1，测试温度范围为23～25 ℃。

拉曼光谱：取适量L-NLC 或空白-NLC 样品滴于覆有锡箔纸的载玻片上，选用50 倍物镜将激光束聚焦于凸起的球状液滴上，并观测和记录谱线。测定条件：以He-Ne 激光器为光源，激发波长为632.81 nm，扫描范围为600～3 000 cm-1，由CCD 多道探测，积分时间为30 s×1。

L-NLC 产品中叶黄素构型变化，参照文献[21]的HPLC 法进行分析，柱温25 ℃；流动相为甲醇-水（98∶2，V·V-1）；流速1.0 mL·min-1；进样量20 μL。

3 结果与分析

3.1 制备条件对叶黄素纳米结构脂质载体品质的影响

在预试验的基础上，重点考察叶黄素载量和液脂MCT 质量分数（基于固液总脂质的质量）对叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）品质的影响，试验结果如图1 所示。

图1 制备条件对L-NLC 品质的影响Fig.1 Effects of preparation parameters on quality of L-NLC

包封率和有效载量是评价L-NLC 品质与应用价值的两个重要参数。固定总脂质质量浓度为5%（g·mL-1）和MCT 质量分数为30%的条件下，测定所得样品的包封率、粒径和PDI。图1（A1）显示，随载量的升高，叶黄素的包封率有一定程度的下降，当载量为3%时，包封率降至73.6%。有效载量可以直观评价叶黄素载入脂质的能力。叶黄素的有效载量随载量增大而逐渐增加的趋势表明，在所试载量范围内，叶黄素能够有效地载入到NLC 中。图1（A2）表明，随载量的提高，L-NLC 的平均粒径逐渐增加，当载量为2%时，平均粒径为168.2 nm。PDI 值随载量的升高呈逐渐增大的趋势，载量2.5%时，PDI 值已大于0.3，表明此时体系分散性较差。因此，在后续研究中固定叶黄素载量为2%。

固定总脂质质量浓度为5%和载量为2%的条件下，测定所得样品的包封率、粒径和PDI。图1（B1）显示，液脂MCT 含量为30%时，包封率最高均值达到88.9%。图1（B2）表明，MCT 含量在15%～40%范围内，L-NLC 粒子的平均粒径先减小后增大，PDI 值呈逐渐增大趋势。在MCT 含量为30%时，对应的平均粒径最小值为168.2 nm，PDI 值为0.28（小于0.3）。平均粒径的先下降，可能是液态脂质和固态脂质黏度不同，脂相的黏度随液态脂质含量的增加而降低，从而降低了NLC 粒子的内部黏度，也相应地降低了固-液界面张力，易于生成粒径小且表面光滑的粒子[13]。平均粒径随后的增大，说明除了黏度因素影响外，还有表面能随分散度增高而增大的影响。初始生成的小粒子表面能高，未及时吸附其他物质或未及时被包覆时，可能自发地聚集成较大粒子，导致NLC 粒子的粒径增加。

固定MCT 质量分数为30%和载量为2%的条件下，测定所得样品的包封率、粒径和PDI。图1（C1）显示，随着L-NLC 中总脂质质量浓度的增加，包封率出现先上升后下降的趋势，相比较而言，在总脂质质量浓度为5%时，包封率具有最高值88.9%。同时图1（C2）显示，随着总脂质质量浓度的增加，L-NLC 粒子的平均粒径呈逐渐增加的趋势，PDI 值亦呈不断增加的趋势，当总脂质质量浓度为5%时，平均粒径为168.9 nm，PDI 值仍小于0.3。为进一步优化L-NLC的制备工艺，后续进行了正交试验。

3.2 正交试验

叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）制备的正交试验因素水平表见表1，正交试验结果及极差分析见表2，正交试验结果方差分析见表3。

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiments

表2 正交试验结果表Table 2 Design and the results of the orthogonal experiments

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

极差分析结果表明，各因素对叶黄素纳米结构脂质载体的影响大小依次为MCT 质量分数＞叶黄素载量＞总脂质质量浓度，方差分析结果表明，MCT 质量分数对包封率有显著影响（P<0.05）。制备叶黄素纳米结构脂质载体的最佳反应组合为A2B2C2。为得到较高含量的叶黄素纳米结构脂质载体水溶液，并综合单因素试验的结果，该工艺确定为：叶黄素载量为2%，总脂质质量浓度5%（g·mL-1），MCT 质量分数（液体脂质占总脂质的比率）为30%，表面活性剂质量浓度2%（g·mL-1），超声功率337.5 W，脉冲为每运行20 s间歇5 s，总时长5 min。按最佳组合方案A2B2C2作验证试验，经3 次重复试验，包封率均值为89.0%，表明正交试验得出的最佳工艺符合实际试验要求。

3.3 粒径分布及光学特征

图2（A）为叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）的粒径分布图。该图显示，L-NLC 粒子的平均粒径为168.2 nm，PDI 值为0.28，小于0.3，表明L-NLC 试样的粒子分散较均一。图2（B）表明，L-NLC 胶体体系的丁达尔效应明显（试样B2和B3），这体现了胶体体系中纳米粒子的共有光学特征。

图2 L-NLC 的粒径分布与光学特征Fig.2 The size distribution and the outer appearance of L-NLC sample

3.4 叶黄素纳米结构脂质载体（L-NLC）结构特征

3.4.1 形貌

图3 是试样的AFM 分析图像，在5 μm×5 μm的扫描范围内，可观测到类球形的粒子的平均粒径为162 nm，这些粒子无聚集、融合现象，分散均匀。相比较而言，AFM 测得的平均粒径略小于动态光散射（DLS）法测的结果（168 nm），这因DLS 法测得的是L-NLC 水化粒子的粒径，而AFM 法观测的是其经干燥后的试样粒径。

图3 新制得的L-NLC 试样的AFM 分析图Fig.3 AFM image of fresh L-NLC sample

3.4.2 晶态

在NLC 粒子中，NLC 的载量和包封率由起到骨架作用的固体脂质晶型所影响[17]；液体脂质的加入可促进固体脂质非完美晶格生成，从而增大NLC 的包埋空间。L-NLC 冻干粉、空白-NLC 冻干粉及山嵛酸甘油酯（ATO）的XRD 分析结果如图4 所示。3 种试样在2 θ 值为21.2 °和23.5 °处均出现较强的衍射峰，反映出ATO 的β 晶型特征[7]。此外，在该图中未发现叶黄素晶体的衍射峰，说明叶黄素分子以非晶态形式分散于NLC 脂质中，这有利于叶黄素的稳定包埋。

图4 ATO、L-NLC 冻干粉和空白-NLC 冻干粉的XRD 谱图Fig.4 XRD patterns of L-NLC freeze-dried powders，Blank-NLC freeze-dried powders and ATO

3.4.3 红外光谱特性

图5 是采用FTIR 技术研究NLC 包埋叶黄素的状况。图中显示，L-NLC 冻干粉和空白-NLC 冻干粉的红外光谱几乎一致。现有的研究[18-19]表明，叶黄素分子在964 cm-l左右存有一个典型的特征吸收峰，该峰为叶黄素共轭多烯链中C－H 面外弯曲振动所产生。而L-NLC 冻干粉的红外光谱中，964 cm-l处吸收峰几近消失，这表明叶黄素已被包埋于NLC 中。

图5 L-NLC 冻干粉、空白-NLC 冻干粉及叶黄素的红外光谱Fig.5 FTIR spectra of L-NLC freeze-dried powders and Blank-NLC freeze-dried powders

3.4.4 拉曼光谱特性

拉曼光谱法具有试样无需前处理和破坏、分析结果不受溶剂水分子振动干扰的优点。如图6 所示，利用拉曼光谱技术对NLC 粒子中的叶黄素分子包埋状况进行了研究。叶黄素的拉曼光谱主要由4 个峰组成，即分子中多烯链的C=C 键的同相伸缩振动（ν1）、C－C 键的同相伸缩振动（ν2）、甲基的平面内摆动（ν3）和氢原子的平面外摆动（ν4）[20]。图6 中，LNLC 冻干粉试样在波数1 532、1 197、1 164 cm-l处分别对应叶黄素的ν1、ν2和ν3的3 个主要拉曼峰。结合3.4.3 的红外光谱分析结果，可认为叶黄素分子已被包埋于NLC 的固液脂基粒子中。

图6 L-NLC 试样和空白-NLC 试样的拉曼光谱Fig.6 Roman spectra of L-NLC sample and Blank-NLC sample

3.4.5 产品中叶黄素构型变化

为了进一步鉴定叶黄素纳米结构脂质载体（LNLC）中叶黄素异构体的组成，采用配有DAD 检测器的HPLC 对L-NLC 进行分析，结果如图7 所示。试验结果表明，L-NLC 制备前（图7B）所用原料叶黄素99%以上为全反式结构（All-E），仅含有少量9 顺式异构体（9Z）；而L-NLC 制备后，图7A 显示，其载运的叶黄素发生了部分构型转化现象，依据李大婧等[21]的研究，可鉴别出13Z 叶黄素和13`Z 叶黄素明显增加，且经峰面积归一化法可得总顺式叶黄素异构体占比达到8.5%，这是由于制备L-NLC 过程的热致全反式叶黄素异构化所导致。

图7 L-NLC 的液相色谱图Fig.7 Liquid chromatography of L-NLC

4 结论

叶黄素的载量和液脂MCT 含量和总脂质浓度影响着L-NLC 的包封率、平均粒径和分散均匀性。在叶黄素载量2%、MCT 质量分数30%及总脂质质量浓度5%（g·mL-1）的条件下，通过溶剂扩散-超声分散联用法可制备出粒径较小（低于170 nm）、体系分散性良好（PDI＜0.3）的L-NLC，被包埋的叶黄素分子以非晶态形式分散到其固液脂基体系中。在载运叶黄素方面，该NLC 制备方法辅以少量绿色试剂乙醇为扩散助剂，具有操作简单、设备要求不高的优势，所得产品有望应用到功能性食品等领域。此外，关于LNLC 中叶黄素生物利用度变化及在贮藏过程中化学稳定性方面的研究，有待下一步开展。