DNMT1单核苷酸多态性与乳腺癌临床病理特征的相关性*

王 蓉,潘小平,赖金国,杜利军,杨 园

广州市花都区人民医院检验科,广东广州 510800

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁女性的生命健康[1]。研究证实环境因素和遗传方式可能导致乳腺癌或增加患乳腺癌的风险[2]。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，在肿瘤基因表达调控、细胞增殖分化等方面起最重要作用。DNA甲基化转移酶(DNMT)是表观遗传学中催化并维持DNA甲基化的重要酶家族。其中DNMT1是DNMT酶家族中最重要也是目前研究最多的一种酶。研究发现DNMT1与DNA异常甲基化有关，从而导致肿瘤的进一步发生、发展,乳腺癌患者外周血中DNMT1 mRNA和蛋白高表达[3]，但是DNMT1多态性与乳腺癌的研究报道较少。本研究选取DNMT1启动子区域的4个多态性位点rs2114724、rs2228611、rs8101866、rs16999593进行研究，拟通过检测分析DNMT1多态性位点的基因型与乳腺癌临床病理特征风险之间的关系，探讨DNMT1多态性与乳腺癌发生、发展的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年4月至2019年12月在本院接受乳腺癌手术且经病理学证实为乳腺癌的患者68例作为病例组,年龄31～85岁，平均(46.8±12.2)岁;另选同期体检健康女性80例作为对照组,年龄28～74岁，平均(44.8±13.9)岁。按照文献[4]乳腺癌的肿瘤大小判定标准分为T1 21例,T2～T4 47例;按照组织学等级分为G1 15例、 G2 27例、G3 26例;按照是否有淋巴结转移分为无转移25例、有转移43例;按照是否有远处转移分为无远处转移56例、有远处转移12例。所有病例术前均未经任何治疗。患者均知情同意，本研究经医院伦理学委员会批准。

1．2仪器与试剂 郎基A300PCR仪购于浙江杭州飞迪生物有限公司，博日HB-T2-D 金属浴加热仪购于杭州诺丁科学器材有限公司，其林贝尔螺旋震荡仪V6RTAX-5购于北京通世华港设备有限公司，ABI 3730xl测序仪购于美国ABI公司，DNA提取试剂盒TSP201-200、PCR试剂1.1×T3 Super PCR Mix购于广州擎科生物技术有限公司，SNaPshot反应试剂盒、内标试剂、HiDi缓冲液均由ABI生物技术中国有限公司提供。

1.3DNA提取 病例组和对照组各采集空腹静脉血3 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝。按照DNA试剂盒步骤，抽提得到DNA，测定DNA水平及A260/A280值，选用DNA水平为50 ng/μL，A260/A280值为1.70～2.10的样本，-80 ℃保存、备用。

1.4PCR扩增产物 按照单碱基延伸引物设计原则，DNMT1 4个多态性位点扩增引物见表1。提取的DNA样品稀释至20 ng/μL后作为PCR模板。PCR反应体系为25 μL,其中1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，10 μmol/L正向引物1 μL，10 μmol/L 反向引物 1 μL，模板(gDNA)1 μL。PCR反应条件：98 ℃预变性2 min，然后98 ℃10 s、58～61 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，35个循环后，72 ℃延伸5 min。反应产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳。

表1 DNMT1 4个多态性位点扩增引物

1.5PCR产物测序 纯化好的混合PCR产物待用，单碱基延伸引物稀释到10 μmol/L，将各位点的等体积单碱基延伸引物混合，得到混合引物，进行SNaPshot PCR，PCR体系及各组分如下：PCR反应体系为5 μL,其中ABI SnapShot multiplex Mix 2 μL，混合引物 2 μL，纯化后PCR模板 1 μL。PCR反应条件为96 ℃预变性2 min，然后96 ℃10 s、50 ℃5 s、60 ℃ 30 s，25个循环。反应产物处理后上ABI 3730xl测序仪进行毛细管电泳测序。

1.6统计学处理 采用统计软件SPSS18.0分析DNMT1多态性位点基因型频率分布，并验证Hardy-Weinberg平衡定律，评估对照组和病例组的基因型，分析各基因型与乳腺癌患者临床病理特征的关系。为了评估同一基因单核苷酸的相关性，利用Haplo View 4.2 software对DNMT1的4个位点进行了连锁不平衡和单体型分析。计算相对优势比(OR)及95%CI，P<0.05表示差异有统计学意义；计数资料比较采用χ2检验，病例资料少于5例时采用Fish精确检验。

2 结 果

2.1DNMT1单个基因型与乳腺癌风险分析 PCR反应后，得到清晰的扩增条带。所有样本经测序后成功分型，经χ2检验，在病例组和对照组中DNMT1各位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，见表2。病例组和对照组DNMT1的4个位点的基因型构成比比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 DNMT1各位点基因型Hardy-Weinberg平衡检测

表3 DNMT1基因多态性与乳腺癌发病风险性研究

2.2DNMT1基因多态性与乳腺癌临床病理学指标的分析 病例组DNMT1 多态性位点rs2228611、rs2114724、rs8101866、rs16999593各基因型频率在乳腺癌临床病理学指标间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 DNMT1基因多态性与乳腺癌临床病理学指标的相关性研究[n(%)]

续表4 DNMT1基因多态性与乳腺癌临床病理学指标的相关性研究[n(%)]

2.3连锁不平衡和单体型分析 DNMT1多态性位点rs2228611、rs2114724和rs8101866之间存在较强的连锁不平衡并且形成一个单体型模块，见图1。为了评估同一基因单核苷酸的相关性，利用Haplo View 4.2 software分析了DNMT1的4个位点连锁不平衡系数(D′)和相关系数 (r2)，依据D′ 和r2值大小，在同一基因内判断各单核苷酸之间关联程度的强弱，对关联性较强的单核苷酸采用单体型分析，分析所有样本中常见的单体型及携带单体型的相对危险度。发现DNMT1多态性位点rs2114724、rs2228611和rs8101866之间存在较强的连锁不平衡，r2>0.8，而rs16999593与以上3个位点之间关联程度较弱，r2<0.2。见表5。对关联较强的rs2114724、rs2228611和rs8101866位点进行了单倍体型分析，发现研究人群中DNMT1最常见的单倍体型为C、G、T，频率为68.4%，少见的单倍体型为T、A、T，频率为3.7%，差异有统计学意义(P<0.05)，表明DNMT1基因中rs2114724、rs2228611和rs8101866位点形成的单倍体T、A、T能显著增加患乳腺癌的风险。见表6。

表6 所有研究对象DNMT1 单倍体型分析

注：1、2、3、4分别代表rs2114724、rs2228611、rs8101866、rs16999593。

3 讨 论

乳腺癌居女性癌症发病首位[1]。在肿瘤进展过程中启动子通过调控基因表达发挥了重要的表观遗传学作用。DNA甲基化是表观遗传学机制最常见的形式，基因启动子区及附近区域CpG岛胞嘧啶的甲基化可以在转录水平调节基因的表达，从而引起相应基因沉默[5]。DNA甲基化是指在DNMT的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上并与其3′端的鸟嘌呤形成 mCpG，且在双链对称出现。异常的基因启动子甲基化能抑制多种抑癌基因的表达。目前研究发现的DNMT家族成员至少包括 DNMT1、DNMT2、DNMT3。其中位于染色体19q13.2的DNMT1是以复制病灶为靶点的最丰富的DNA甲基转移酶，并且在细胞分裂过程中起最主要的、稳定的维持甲基化状态作用[6]。DNMT1不仅与胚胎发育、细胞衰老有关，也与肿瘤的发生密切相关。DNMT1高表达可以使甲基化模式发生异常，抑癌基因沉默、原癌基因激活导致肿瘤发生[7]。DNMT1的多态性与人类乳腺癌[8]、结直肠癌[9]、卵巢癌[10]等有关。DNMT1在乳腺癌中能导致许多抑癌基因发生甲基化，如P53[11]、PTEN[12]、APG等。目前，有两项关于中国人群DNMT1多态性与乳腺癌的研究，在黑龙江人口的一项研究中发现中国人群DNMT1 rs16999593的杂合子基因型CT的频率病例组低于对照组[13]；而在中国南方人群中调查发现相同位点基因型CT能显著增加患乳腺癌的风险，广东人群DNMT1 rs2228612位点和重庆人群DNMT1 rs2114724和rs2228611与乳腺癌易感性相关[14]，可以看出结果存在差异。

本研究发现，病例组和对照组在各位点基因型频率和等位基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，位点rs16999593的CT基因型频率在两组间并没有较大差别，与野生基因型TT相比，杂合子基因型CT和突变基因型CC能显著增加患乳腺癌的风险。SUN等[14]报道在病例组和对照组DNMT1 rs16999593杂合子CT能明显增加患乳腺癌的风险，这与本研究结论不同。分析可能的原因：(1)研究对象背景不同，遗传结构可能存在一定差异；(2)纳入的符合要求的样本量不同，可能会导致统计结果偏倚；(3)检测方法不同，可能会导致检测结果不一致。扩大符合要求的样本统计是本课题下一步工作的重要内容之一。此外，在本研究人群中DNMT1(rs2228611、rs2114724、rs8101866)3个多态性位点彼此间存在较强的关联，4个位点单核苷酸可以形成连锁不平衡结构图，这说明中国妇女DNMT1 rs2228611、rs2114724、rs8101866位点多态性可能与乳腺癌易感性相关，还发现样本中单体型C、G、T的频率明显高于单体型T、A、C和T、A、T，差异均有统计学意义(P=0.017)，携带T、A、T单倍体型的人群患乳腺癌的风险显著增加。这与SUN等[14]研究结果不一致，其认为DNMT1基因的位点rs2228611、rs2114724、rs8101866和rs16999593形成的单倍体C、G、T、C能明显增加患乳腺癌的风险，结论的不同还需要增加样本量等进一步探讨。通过对临床病理指标的分析发现，在发病年龄、组织学分级、肿瘤大小、淋巴结状态、远处转移、ER和PR状态等方面，乳腺癌患者DNMT1多态性位点rs2228611、rs2114724、rs8101866、rs16999593各基因型频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究进一步探讨了乳腺癌中DNMT1单核苷酸多态性与以上临床病理特征的关系，也进一步证明了DNMT1可能参与了乳腺癌的发生，但与病程的发展还有待进一步深入研究。

DNA甲基化是调控基因表达的表观遗传学的重要机制之一，DNMT表达状态影响着细胞基因的表达调控。本研究通过对DNMT1多态性位点的分析评估了其与乳腺癌发生、发展的相关性。位点rs16999593能增加患乳腺癌的风险，但分子机制还有待进一步阐明，今后也将扩大样本进行分层分析，为乳腺癌的早期筛查、诊断及DNMT1抑制剂的使用提供更加准确的科学依据。