核酸适配体在败血症实验诊断中的初步应用*

王志瑛，向 韡，李卫滨,3△

1.联勤保障部队第九〇〇医院检验科，福建福州 350025；2.厦门大学公共卫生学院，福建厦门 361100; 3.福建医科大学医学技术与工程学院，福建福州 350025

败血症是由于各种细菌感染引起的全身炎症反应综合征，是临床上常见的重症感染，也是全球性的公共卫生问题。在世界范围内，每年有超过1 800万人感染败血症，其病死率高达40%[1]。败血症病原体的快速检测，对提高患者的生存率至关重要。目前，败血症实验诊断的方法主要是检测C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、血细菌培养，存在特异度不理想和检测时间长等局限性。相比之下，近来出现的基于聚合酶链反应(PCR)能够将诊断时间缩短至数小时，但是难以在基层医院开展。核酸适配体是通过指数富集的配基系统进化(SELEX) 技术产生的核酸分子探针，相比于传统的检测抗体，适配体的生产成本低，化学性质稳定，不存在批间差。检测靶标涵盖小的有机分子到复杂的蛋白质或全细胞，几乎能与自然界中所有的分子相互作用[2]。肽聚糖为革兰阳性和革兰阴性细菌共有的细胞壁聚合物[3]，占革兰阳性菌细胞壁干重的50%～80%，革兰阴性菌的细胞壁干重的5%～20%，Antibac1 和Antibac2 为肽聚糖核酸适配体序列[4-5]，本研究旨在以Antibac1 和Antibac2为分子探针初步建立基于适配体的qPCR新方法用于细菌检测。

1 材料与方法

1.1材料 细菌菌株：大肠埃希菌ATCC 25922，金黄色葡萄球菌ATCC 29213，铜绿假单胞菌ATCC 27853，白色念珠菌，以上均为联勤保障部队第九〇〇医院检验科微生物室保存菌株。

1.2仪器与试剂 磷酸盐缓冲液(PBS)由本实验室配制(137 mmol/L NaCl2,2.7 mmol/L KCl,4.3 mmol/L Na2HPO4·7H2O,1.5 mmol/L KH2PO4)；细菌培养平板为哥伦比亚血琼脂培养基，购自梅里埃生物制品有限公司；细菌培养温箱为35 ℃二氧化碳培养箱，购自美国SHELLAB-2306；比浊瓶为无菌生理盐水缓冲液，购自梅里埃生物制品有限公司；DENSIMAT细菌比浊仪，购自梅里埃生物制品有限公司；PCR仪为Bio-Rad的CFX-96 Real-Time System，C1000 Thermal Cycler，操作系统为Bio-Rad CFX Manager，购自美国伯乐公司；荧光染料SYBR Green Ⅰ、PCR Taq Mix、qPCR Mix购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3适配体与随机序列库 适配体Antibac1：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GGG GAC AGG GAG TGC GCT GCT CCC CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；适配体Antibac2：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GGG GGA CTA GAG GAC TTG TGC GGC CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；随机核酸序列文库：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GTT CCA ACA TAG TGT CTG ATT TTC TTA ATG GTA GGC GAG CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；随机核酸序列正向引物：5′-TCG CGC GAG TCG TCT G-3′；随机核酸序列反向引物：5′-GGG AGG ACG ATG CGG-3′。随机序列的正反向引物与Antibac1和Antibac2的3′端和5′端有相同结合位点[5]。以上适配体、随机序列核酸文库与引物均由上海生工生物技术公司合成。

1.4方法

1.4.1菌株培养与调配 实验菌株在35 ℃二氧化碳温箱中培养24 h，挑取3～4个单菌落加入去热源EP管中，振荡混匀，室温用PBS 8 000×g离心10 min洗涤3次，弃上清液，用适量PBS将沉淀吹打混匀，加入测定浊度专用玻璃瓶中，在吸光度600 nm波长下将吸光度值调整为0.5个麦氏比浊单位。操作方法参考文献[6]并根据实验室的条件进行了优化。

1.4.2适配体-细菌结合反应 将50 μL调制好的菌悬液加入经牛血清清蛋白(去除非特异结合)包被过夜的EP管中，再加入50 μL的适配体序列Antibac1及Antibac2(0.1 μmol/L)在室温下震荡孵育结合45 min。在上述适配子-细菌结合物中加入1 mL PBS，颠倒混匀3次，8 000×g离心6 min洗涤结合物3次，最后一次洗涤将上清全部弃去。在EP管中加入25 μL无菌水重悬适配体，将EP管置于95 ℃水浴锅中洗脱适配体5 min，8 000×g，4 ℃条件下离心5 min，吸取1 μL上清(含洗脱适配体)加入20 μL PCR体系进行qPCR定量测定。

1.4.3实时qPCR分析 PCR体系：10 μL Mix，3 μL上游引物(10 μmol/L)，3 μL下游引物(10 μmol/L)，3 μL无菌水，1 μL模板(0.1 μmol/L)。 qPCR条件：95 ℃预变性1 min，40个循环的95 ℃变性45 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，平行实验3次，以随机序列库作为对照。

1.4.4亲和力标准曲线测定 配制PCR反应混合体系,先在各管加入17 μL混合体系，再在1～6各管依次加入3 μL梯度浓度的模板，第7管加入3 μL无菌水，各管浓度依次设为10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1 μmol/L。

1.5统计学处理 根据不同浓度适配体qPCR测定结果进行 Linewaver-Burk的非线性回归分析，使用公式1/[complex] = kd/[Cmax] × 1/[aptamer] + 1/[Cmax]进行计算解离常数(kd)值。其中kd值是稳定状态下适配体的解离常数；[complex]是细菌-适配体复合物的浓度；[Cmax]是在适配体的最大结合效率下，也就是细菌的所有位点都被适配体占据的情况下复合物的浓度；[aptamer]是实验中适配体的浓度[5]。

2 结 果

2.1适配体Antibac1的特异度 qPCR-CQ值显示，0.1 μmol/L适配体Antibac1能够识别大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，与白色念珠菌结合CQ值很低，说明特异度较好,见图1。

图1 适配体 Antibac1结合特异度实验

2.2适配体Antibac1的灵敏度 将不同浓度适配体Antibac1分别与0.5个麦氏单位的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌菌液结合，测定CQ值，说明10-6μmol/L适配子可以检测到1.5×108细菌数,见图2。

图2 适配子Antibac1结合灵敏度实验

2.3适配体Antibac1亲和力标准曲线 为了进一步分析适配子的结合效率，采用实时qPCR的方法测定了适配体Antibac1和Antibac2对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的结合力。DNA稀释度-ΔCQ值的图表(图3)显示适配子Antibac1对不同细菌的扩增效率大致相同，相对于随机序列文库，适配体Antibac1能够以更高的结合效率与临床常见的致病性金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌相结合。

注：SA表示金黄色葡萄球菌；e.coli表示大肠埃希菌；p表示铜绿假单胞菌。

2.4适配体Antibac1解离常数kd值的测定 适配体Antibac1对于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的kd值分别为33.3、102.7、373.7 μmol/L。而Antibac2对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的结合不理想，kd值无法计算。适配体Antibac1与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的结合亲和力见图4，kd值越小，亲和力越高，说明Antibac1与大肠埃希菌结合亲和力最强。

图4 Antibac1结合亲和力kd值计算

3 讨 论

本研究目标聚焦细菌细胞壁肽聚糖的适配体Antibac1和Antibac2对细菌的检测，采用qPCR方法分析Antibac1和Antibac2与3种败血症主要细菌的特异度与灵敏度及结合亲和力。本研究结果表明，Antibac1对不同的细菌结合效率都较高，不仅能结合革兰阳性菌种(金黄色葡萄球菌)，还结合革兰阴性细菌(大肠埃希菌、铜绿假单胞菌)，说明Antibac1能够识别这3种细菌细胞壁中的靶分子，Antibac1的结合亲和力甚至有可能反映出这些细菌的细胞壁上肽聚糖的差异[4]。理论上Antibac1与金黄色葡萄球菌结合亲和力应该强于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，但结果其与大肠埃希菌结合亲和力最强，下一步将增加细菌种类进一步验证[5]。目前，基于核酸适配体的生物传感器已经开始应用于细菌性疾病的检测[7]。这些细菌易引发菌血症、败血症，甚至脓毒血症，是重要的医院获得感染病原菌，是重症监护病房感染的常见病原体[8]。

适配体Antibac1和Antibac2检测结果的差异，可能是因为两个适配体的qPCR扩增、洗脱条件不同，需要进一步优化Antibac2与细菌结合条件以及PCR扩增条件。下一步将合成荧光标记的适配体序列，在荧光显微镜下确认适配体与菌体的结合，佐证适配体结合的特异度。另外，qPCR扩增时增加 “内参序列”，并加入其对应的引物序列一起扩增以监测扩增体系的稳定性，确保整个扩增过程的标准化。

近年来在诊断领域，核酸适配体广泛应用于特异性地识别和结合多种类型的靶标，包括活细胞或细菌。适配体作为小分子，化学性质稳定、生产成本低、生产不存在批间差，另外，其对pH值和温度等环境变化具有很强的适应性，并且在结构设计中具有显著的灵活性。因此，基于适配体的生物传感器能够克服传统的抗体生物传感器的一些缺点，目前已经开发了多种用于微生物病原体检测的适配体传感器[9]。

总之，本研究证实，靶向细菌肽聚糖的ssDNA适配体能够识别败血症几种相关的革兰阳性与阴性细菌，Antibac1可用于开发生物传感器探针，在临床中快速检测细菌，亦可联合使用不同的核酸适配体，提高对于不同类型细菌的检测效率，加速诊断和治疗，提高败血症患者的生存率。