慢性心力衰竭患者外周血单个核细胞miR-590表达与左心室重构和炎性反应的关系*

朱洪新，王 涛，王 皓，霍建凤

秦皇岛市第二医院：1.心内科；2.呼吸科,河北秦皇岛 066600

左心室功能障碍和左室射血分数(LVEF)降低患者心力衰竭进展过程中通常伴随着进行性的左心室扩张和左心室重构[1]。慢性心力衰竭(CHF)可能发生在心肌梗死、血流动力学超负荷或原发性心肌疾病患者中。尽管这些疾病的病因不同，但它们有着共同的病变途径，最终导致病理性左心室肥厚和左心室重构的发生。左心室重构是由多种生长因子和细胞因子之间复杂的相互作用所介导的，例如神经体液因子、细胞炎症因子、氧化应激、机械应力等[2]。此外，各种应激诱导的microRNAs(miRNAs)也是心力衰竭发生机制的关键调节因子，并有望成为新的治疗靶点。应激诱导的miR-590被认为是病理性心肌肥大和心肌纤维化的有效调节因子，其作用与靶向作用于炎症信号通路有关。基于一些基础研究和动物实验[3-4]，推断外周血单个核细胞(PBMC)中miR-590表达与CHF患者的左心室重构和功能障碍有关。在本研究中连续采集了134例CHF患者的血液样本以探讨PBMC中miR-590相对表达水平与超声心动图表现、炎性反应之间的关系，并试图找出预防和治疗CHF进展的新靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2019年6月在本院就诊的CHF患者134例作为研究组，其中男性78例、女性56例，年龄为39～87岁、平均(65.96±11.91)岁。CHF诊断基于病史、体格检查、心电图、胸部放射学、超声心动图和冠状动脉造影，符合CHF的诊断标准[5]。纳入标准：(1)纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级Ⅱ～Ⅳ级[6]；(2)LVEF≤50%，心力衰竭持续≥4周；(3)有心肌梗死病史、高血压(原发性高血压诊断)和特发性扩张型心肌病病因。这些CHF患者服用标准药物治疗方案，包括利尿剂、正性肌力药(如地高辛)、他汀类、β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和(或)血管紧张素1型受体阻滞剂(ARB)。排除标准：(1)维持性血液透析的终末期肾病、先天性心脏病、心包炎、原发性瓣膜病、肥厚性心肌病、急性心肌炎或任何已知系统疾病引起的继发性心肌病者；(2)合并感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤者。另选取同期本院的69例健康志愿者作为对照组，其中男性40例、女性29例，年龄为36～89岁、平均(66.72±13.85)岁，无急性或慢性疾病或心血管系统相关症状。对照组和研究组受试者年龄和性别构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本院医学伦理委员会批准了包括血样分析在内的研究方案，并获得所有患者的书面知情同意书。

1.2超声心动图检查 所有患者完成基础检查、平板运动试验，并使用Acuson Sequoia C256和Acuson Sequoia512超声仪(探头频率为2.0～3.5 MHz)在左侧仰卧位进行了二维超声心动图和多普勒检查。通过优化增益设置、扇形角度和深度，获得标准胸骨旁长轴视图及3个标准的心尖四腔、二腔和长轴视图。左室舒张末期容积(EDV)和左室收缩末期容积(ESV)按双平面Simpson法计算。测量平均室壁应力(MWS)。根据美国超声心动图学会和欧洲心血管成像协会的建议，采用M-mode法测定左室质量指数(LVMI)。EDV为96～157 mL(男性)和59～138 mL(女性)，ESV为33～68 mL(男性)和18～65 mL(女性)被视为正常值。LVMI为>125 g/m2(男性)和>120 g/m2(女性)视为左心室肥厚。随访至2020年8月，通过超声心动图测定这些值。超声心动图图像由两名独立的心脏病专家分析且不知道患者的身份。

1.3PBMC提取和miR-590相对表达水平检测 采集所有研究对象外周静脉血5 mL，采用Ficoll密度梯度离心法提取PBMC。利用mirVana PARIS提取试剂盒提取PBMC的总miRNAs，保存在-80 ℃下。加入等体积变性液后，加入50 pmol/L的秀丽隐杆线虫miR-39(cel-miR-39)作为对照。采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒和特异性引物在ABI-7900实时PCR检测系统中进行实时荧光定量PCR，扩增程序包括95 ℃预变性5 min，随后95 ℃变性30 s+60 ℃30 s+72 ℃30 s共循环40个周期，收集熔解曲线。当熔化过程中的荧光信号为单重态时，结果是可靠的。采用2-ΔΔCt公式对其相对表达水平进行分析，用参考基因U6 mRNA校准各样本miR-590相对表达水平。miR-590引物序列：正向5′-TAG CCA GTC AGA AAT GAG CTT-3′，反向5′-TGC TGC ATG TTT CAA TCA GAG A-3′。

1.4血清炎症因子水平检测 取血清,采用全自动生化免疫分析仪(ChemWell2910型)及其配套试剂盒进行检测，采用双抗体夹心法原理测定血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。另外取另一支含有2 mL血样的试管，加入40 μL抑肽酶及30 μL 10%乙二胺四乙酸二钠充分混匀，利用Beckman Array360 System及配套的诊断试剂盒，采用免疫散射比浊法测定血清超敏C反应蛋白(hs-CRP)。

2 结 果

2.1两组PBMC中miR-590相对表达水平比较 研究组患者PBMC中miR-590相对表达水平为0.80±0.28，低于对照组(1.00±0.11)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2不同心功能级别的研究组各指标水平比较 研究组NYHA心功能分级Ⅳ级患者PBMC中miR-590相对表达水平低于Ⅱ～Ⅲ级患者，其血清IL-6、TNF-α、hs-CRP水平及EDV、ESV、LVMI、MWS高于Ⅱ～Ⅲ级患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同心功能级别的研究组各指标水平比较或M(P25,P75)]

NYHA分级n左心室重构EDV(mL)ESV(mL)LVMI(g/m2)MWS(kPa)Ⅱ级38138.53±25.9847.03±25.98110.59±12.5929.66±5.40Ⅲ级54134.74±44.7760.93±24.83a116.31±15.4333.42±5.25aⅣ级42156.21±42.70ab89.74±33.07ab130.54±17.58ab40.01±4.40abF/Z3.73524.75018.23043.770P0.026<0.001<0.001<0.001

2.3CHF患者PBMC中miR-590相对表达水平与血清炎症因子、左心室重构指标的关系 Pearson相关分析显示，研究组患者PBMC中miR-590相对表达水平与血清IL-6、TNF-α、hs-CRP、EDV、ESV、LVMI、MWS呈负相关(r=-0.610、-0.451、-0.568、-0.455、-0.631、-0.432、-0.727，P<0.05)。

2.4多元线性回归分析 以EDV为因变量，校正年龄、性别构成、病因、体质量指数、吸烟史、糖尿病史、IL-6、TNF-α、hs-CRP(包含ESV、LVMI、MWS)等因素，进行多元线性回归分析，结果显示PBMC中miR-590相对表达水平与EDV呈负相关(P<0.05)；同样以ESD为因变量，校正上述混杂因素(包含EDV、LVMI、MWS)，多元线性回归分析结果显示PBMC中miR-590相对表达水平与ESV呈负相关(P<0.05)；以LVMI为因变量，校正上述混杂因素(包含ESD、EDV、MWS)，多元线性回归分析结果显示PBMC中miR-590相对表达水平与LVMI呈负相关(P<0.05)；以MWS为因变量，校正上述混杂因素(包含ESD、EDV、LVMI)，多元线性回归分析结果显示PBMC中miR-590相对表达水平与MWS呈负相关(P<0.05)。见表2。

表2 多元线性回归分析PBMC中miR-590和左心室重构指标的关系

3 讨 论

CHF是一种全球性的心脏疾病，疾病进展与左心室重构有关，表现为EDV、ESV逐渐增加，室壁变薄，LVEF持续下降，炎症细胞因子在这个过程中发挥着重要作用。目前标准治疗方法包括ACEI、ARB、β受体阻滞剂等对于延缓CHF进展有益，但是其预后仍不甚理想，致残率和病死率较高，患者生活质量严重下降。因此，深入阐述CHF的发病机制对于探索和开发替代治疗策略，具有重要的临床意义。本研究结果显示研究组PBMC中miR-590相对表达水平较对照组降低，而且随着NYHA心功能分级的升高PBMC中miR-590相对表达水平进一步下调，说明miR-590在CHF疾病进展过程中属于功能性因子，对于心功能降低有一定的保护作用；此外，CHF患者PBMC中miR-590相对表达水平与血清炎症因子、左心室重构指标呈独立负相关，这也进一步为支持miR-590可能参与CHF患者的心脏重构和功能障碍提供了可靠的证据。

CHF发生和发展的炎症机制早已被众多基础和临床研究所证实，无论是通过细胞因子激增、抗体生成还是细胞反应，促炎因子(如TNF-α、IL-6、hs-CRP)都是疾病进展的媒介[7-8]。促炎细胞因子通过介导内皮功能障碍、氧化应激、诱导贫血、诱导心肌细胞凋亡和肥大，引发一系列有害事件，最终导致心肌细胞收缩功能障碍[7-10]。ESKANDARI等[11]证实，CHF患者外周血PBMC中TNF-α和IL-6 mRNA表达及循环血清中的相应表达水平显著增加，并且与CHF疾病严重程度呈正相关，说明慢性心脏病患者外周血中促炎因子TNF-α和IL-6的表达是反映病情严重程度和预后的重要指标。本研究CHF患者PBMC中miR-590相对表达水平与炎症因子IL-6、TNF-α、hs-CRP均呈负相关，说明miR-590可能是通过参与炎性反应进而影响左心室重构进程。

EULALIO等[12]以高通量筛选方法培养了新生大鼠心室肌细胞，发现204个miRNAs显著增加了乳鼠心肌细胞的增殖，尤其是miR-590可显著促进出生7 d后乳鼠心肌细胞的增殖活性，而且进一步通过细胞实验证实，上调miR-590可激活细胞周期和促进心肌细胞增殖。此外BRAGA等[13]证实在心肌梗死期间，miR-590不仅能刺激心脏再生，还能保护心脏功能，减少心脏纤维化。miR-590基因位于染色体7q11.23，成熟miR-590是在细胞核内进行编码并在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成初级miR-590(pri-miR-590)，然后经剪切形成发夹状结构的前体miR-590(pre-miR-590)。pre-miR-590又进一步被Dicer剪切生成双链RNA，即miR-590/miR-590*。miR-590通常是指miR-590-5p，属于靠近5′端茎部的miRNA；miR-590*是指靠近3′端茎部的miR-590-3p，miR-590-3p通常很不稳定，经Dicer加工成熟后很快降解。因此更具备临床研究价值的是miR-590。EKHTERAEI-TOUSI等[14]报道miR-590的主要作用靶点为转化生长因子β受体(TGF-βR)，miR-590可直接作用于TGF-βRⅡ的3′UTR，下调TGF-βRⅡ水平，进而抑制Ang Ⅱ诱导的胶原蛋白分泌及肌成纤维细胞转化，从而发挥抗纤维化效应。SINGH等[15]也认为上调miR-590-3p表达抑制大鼠或猪心脏成纤维细胞中特异性蛋白1的表达，上调心肌肌钙蛋白T的表达水平，并推测这可作为增强人类心脏细胞重编程的替代途径。此外,何平平[16]通过动物实验也证实，miR-590可抑制Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化病变的发生、斑块内的脂质蓄积、血浆脂质水平和炎症因子的表达等。这些研究将为miR-590作为心肌梗死后恢复心功能的治疗靶点的潜在作用提供有用的生物学信息。

本研究通过校正各种临床混杂因素及炎症因子因素，经多元线性回归分析证实，CHF患者PBMC中miR-590相对表达水平与EDV、ESV、LVMI、MWS等左心室重构指标都呈独立负相关，说明miR-590对于左心室重构过程有一定的影响，检测PBMC中miR-590相对表达水平在一定程度上可反映心力衰竭进展。左心室重构通常是一个渐进的过程，开始于心肌损伤或过度的左心室负荷，其特点是心室容积缓慢递增，左心室质量增加，壁厚适度增加，这主要是由于心肌损伤早期心肌细胞过度生长所致[17]。在某种程度上，最初的心肌重构可能被认为是有益的，因为通过增大心室腔的空间进而保留一定的射血分数，但是，当左心室扩张到一定程度时，这种适应机制可能会朝着不适应的重塑和左心室病理性肥厚发展。在这一阶段中，增加的负荷由增加LVMI和MWS来补偿，最终导致整个心室收缩能力的进行性下降[18]。因此，EDV、ESV、LVMI、MWS对于左心室重构过程都有一定的相关性。而miR-590与这些参数都有一定的独立相关性，说明检测PBMC中miR-590相对表达水平在一定程度上可以预测不良左心室重构的后续发展。

综上所述，对于CHF患者，miR-590表达与左心室重构指标(EDV、ESV、LVMI、MWS)均呈独立负相关，PBMC中miR-590相对表达水平降低在一定程度上反映了不良左心室重构，这可能与miR-590参与炎性反应调节有关。本研究结论为深入阐述CHF进展机制及寻找临床治疗靶点提供了新的思路。