2型糖尿病患者外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平与糖脂代谢、炎性因子及胰岛素抵抗的关系研究*

侯黎明，刘迎见△，舒闪闪

1.新乡医学院附属商丘市第一人民医院内分泌科，河南商丘 476100； 2.商丘市妇幼保健院检验科，河南商丘 476000

2型糖尿病(T2DM)是内分泌科常见的一种代谢性疾病，主要特点为高血糖，病理基础为胰岛素分泌不足、胰岛素抵抗，该病危害性较大，可引起神经性病变，增加病死率[1]。T2DM患者的糖代谢紊乱状态持续存在，长期胰岛素抵抗会影响心肌细胞利用葡萄糖，导致心脏所需能量不足，严重时可致心功能损害[2]；脂代谢异常是糖尿病肾病恶化的影响因素之一[3]，在T2DM进展过程中，糖脂代谢异常、炎性因子、胰岛素抵抗均会引起T2DM患者病情恶化。近年来，有研究指出，微小核糖核酸(miRNA)参与了β细胞分化、糖尿病肾病等病变的发生、进展过程[4]。有学者发现，miR-125b对胰岛细胞凋亡有调节作用[5]。另有研究提示，miR-18a作为miRNA的重要组成部分，参与了多种疾病的慢性应激过程，增加了机体患病风险[6]。单个核细胞包括两类细胞，分别为淋巴细胞、单核细胞，可吞噬衰老细胞，通过检测单个核细胞内相关因子表达情况，更能反映机体功能变化[7]。故本研究选取88例T2DM患者作为研究对象，分析T2DM患者外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平与糖脂代谢、炎性因子及胰岛素抵抗的关系，通过探讨相互之间的关系，进一步了解T2DM患者病情，旨在为T2DM治疗提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年5月至2020年6月新乡医学院附属商丘市第一人民医院收治的T2DM患者88例(T2DM组)作为研究对象，另选取同期于该院体检的健康志愿者65例作为对照组。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。研究方案获该院伦理委员会批准，两组均对研究内容知情同意。研究对象均符合T2DM诊断标准[8]：出现明显的糖尿病症状，如多食、烦渴多饮、多尿等，且随机血糖≥11.1 mmol/L；空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L；口服葡萄糖耐量试验提示餐后2 h血糖(2 hPG)≥11.1 mmol/L。

表1 两组一般资料比较

1.2纳入、排除标准

1.2.1纳入标准 T2DM组：(1)满足上述关于T2DM的诊断标准；(2)认知状态、精神状态正常。对照组：(1)身体健康状况良好；(2)性别、年龄资料与T2DM组匹配；(3)认知状态、精神状态正常。

1.2.2排除标准 (1)出现急性并发症；(2)肾脏、肝脏、心等脏器严重受损；(3)恶性肿瘤；(4)自身免疫性疾病；(5)近6个月内有外科手术史；(6)1型糖尿病或妊娠糖尿病；(7)伴急/慢性感染。

1.3方法

1.3.1样本采集 两组于就诊或体检当日，采集5 mL空腹静脉血，分装于两管，一管用于检测外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b，另一管用于检测糖脂代谢、炎症指标。

1.3.2外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b检测 采集3 mL空腹肘静脉血，行抗凝处理，利用密度梯度离心法分离单个核细胞，经Trizol试剂(北京雷根生物技术有限公司，NR0002)对总RNA进行提取，加入Trizol试剂500 μL，充分混合，在室温下放置5 min，而后加入100 μL氯仿(上海研生生化试剂有限公司，YS-0043B)，震荡混合，放置2 min，使用高速离心机(湘仪集团，H1650)在4 ℃下行离心处理，时间为15 min，12 000 r/min，将上清液弃除。取100 μL异丙醇(西安晋湘药用辅料有限公司，497-19-8)加入，充分混合后离心处理，将上清液弃除。取75%冰乙醇100 μL加入，离心后弃除上清液。经空气干燥机(杭州超滤实业有限公司，CLRD-SA/W)干燥5～10 min，去除蛋白及水分。取焦炭酸二乙酯(美国Amresco，E174-5G)20 μL，使RNA完全溶解，存放于低温冰箱(中科都菱，MPC-5V1500)待测。经紫外分光光度计(上海光谱仪器，SP-2500)对RNA样品的纯度予以检测，分别在280、260 nm波长处各测1次，明确A260与A280比值，若比值处于1.8～2.1提示满足检测标准。各样本均取RNA 1 ng经反转录成cDNA，反应条件设定为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。荧光定量聚合酶链反应(PCR)反应引物序列如下：miR-18a上游引物为5′-GTG CTA AGG TGC ATC TAG CAG-3′，下游引物为5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；miR-125b上游引物为5′-GGA TGG TGT TAT AGG AGG TTG TG-3′，下游引物为5′-CTC TTT CCC CCA AAA CAA ATA TAC-3′；以U6为内参基因，上游引物为5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物为5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。PCR反应条件为预变性95 ℃ 20 s，变性95 ℃ 10 s、退火57 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 15 s，共40个循环，检测仪器为PCR检测仪(上海科源电子科技，Quick1600)，经2-ΔΔCt法表示miR-18a、miR-125b相对表达水平。

1.3.3糖脂代谢及炎性因子检测 将采集的血样行离心处理，转速3 000 r/min，离心时间10 min，离心半径8 cm，分离血清，经博科生物(山东)BK-200全自动生化分析仪与配套试剂测定血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。经酶联免疫吸附试验法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-15、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，试剂盒购自江莱生物(上海)，经放射免疫分析法测定空腹胰岛素(FINS)，试剂盒购自上海瑞齐生物科技有限公司。经厚美德生物(青岛)GLS-77血糖分析仪测定2 hPG、FPG，经涵飞医疗(上海)CS2000糖化血红蛋白(HbA1c)分析仪测定HbA1c。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

2 结 果

2.1两组外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平比较 T2DM组外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平比较

2.2两组血糖及胰岛素抵抗指标比较 T2DM组2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组血糖及胰岛素抵抗指标比较

2.3两组脂代谢指标比较 T2DM组TC、TG、LDL-C高于对照组，而HDL-C低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 两组脂代谢指标比较

2.4两组血清炎性因子比较 T2DM组血清IL-1β、IL-6、IL-15及TNF-α高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 两组血清炎性因子比较

2.5T2DM患者外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平与各指标相关性分析 外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平与2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、LDL-C、IL-1β、IL-6、IL-15、TNF-α呈正相关，与HDL-C呈负相关(P<0.05)，但二者与TC、TG无相关性(P>0.05)，见表6。

表6 T2DM患者外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平与各指标相关性分析

3 讨 论

据国际糖尿病联盟数据显示，我国2013年T2DM患病率已高达10.4%[9]。该病发病机制比较复杂，临床上尚未完全明确其特点，既往研究采用血糖、血脂等常规指标评估患者病情，虽然具有一定价值，但仅能反映糖脂代谢、胰岛素反应的变化，存在局限性，临床仍需寻求可靠指标对其病情进展予以判断，为治疗提供依据。既往有学者认为，过表达的miR-18a可能具有扰乱机体蛋白质代谢，削弱肾脏、血管等生理功能的作用[10]。miR-125b表达可能影响血管平滑肌细胞的分化[11]。临床通过评估T2DM患者外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平，可能有利于进一步了解病情，提出针对性干预方案。

本研究结果显示，T2DM组外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-18a是miR-17-29家族的一员，其异常表达与机体免疫存在关联，在免疫应答、细胞发育中有重要作用[12]。miR-18a可通过调节酪氨酸激酶-转录激活因子通路，促进炎症介质释放，导致机体炎症加重，它在低度炎症进展中发挥了重要作用[13]。基于此，笔者推测miR-18a可能通过其对炎症介质的调控作用，参与T2DM进展。有学者认为miR-125b过表达对高糖诱导的炎性反应有促进作用，从而加速内皮细胞损伤，影响内皮细胞功能，这可能是其过表达促进糖尿病进展的原因[14]。研究表明T2DM患者的辅助性、调节性T细胞处于不平衡状态[15]。而高表达的miR-125b则可能通过影响B淋巴细胞诱导成熟蛋白和干扰素调节因子-4的表达，引起辅助性、调节性T细胞失衡[16]。

本研究结果显示，与对照组相比，T2DM组2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR及TC、TG、LDL-C显著升高，而HDL-C下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示T2DM患者存在糖脂代谢紊乱与胰岛素抵抗。糖尿病患者存在糖脂代谢紊乱，这主要是由于患者的胰岛素功能障碍或胰岛素分泌不足所致，症状包括餐后血糖或FPG上调及血脂代谢异常，引起胰岛素抵抗及血糖、血脂指标增高[17]。当人机体持续处于高血糖状态时，会出现胆固醇累积，导致动脉血管壁脂质沉积速度增快，促进动脉粥样硬化的发生[18]。血脂代谢异常也与胰岛素抵抗有关，随着病程延长，可能出现心肌代谢障碍，引起心肌缺血，胰岛素抵抗贯穿于T2DM发病的整个过程[19]。本研究发现,T2DM组血清IL-1β、IL-6、IL-15及TNF-α高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明患者存在炎症。持续血糖增高会影响单个核细胞合成功能，促进炎症介质大量释放，IL-1β、IL-6、IL-15均为促炎因子，可加重机体炎症严重程度，三者均通过单个核细胞进行释放，能对趋化蛋白予以介导，对糖尿病患者病情影响较大[20]。TNF-α与糖尿病并发症发生存在关联，也可加重糖尿病患者的机体炎症[21]。基于此，临床要加强对患者机体炎症的观察，以便调整治疗方案。本研究最终证实，T2DM患者的外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b相对表达水平与2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、LDL-C、IL-1β、IL-6、IL-15、TNF-α呈正相关，与HDL-C呈负相关，表明患者miR-18a、miR-125b表达与糖脂代谢、炎性因子、胰岛素抵抗存在关联。T2DM患者的糖脂代谢紊乱、炎症程度、胰岛素抵抗相应呈进行性发展，miR-18a可能通过调控炎症介质促进T2DM进展，miR-125b则可加重高糖诱导的炎性反应程度，引起内皮细胞损害，参与T2DM进展。外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b的高表达均可加重T2DM病情，二者相对表达水平越高，意味着血糖控制越差，继而导致糖脂代谢紊乱、炎性反应与胰岛素抵抗进一步加重。

综上所述，T2DM患者外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b表达明显上调，且这类患者存在糖脂代谢紊乱、炎性反应及胰岛素抵抗，而外周血单个核细胞miR-18a、miR-125b表达与上述表现存在相关性。此外，本研究也存在一定的局限性，如样本量较少，且T2DM发生机制复杂，可能有多个miRNA参与，受研究经费限制本研究仅选择了miR-18a、miR-125b进行观察，未来还需加大样本量对此进行拓展研究。