超声处理对羊乳中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果

任 荣，张安琪，张富新，刘玉芳，王维哲，贺 超，刘莹莹，王毕妮

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119）

乳中富含碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质等多种营养成分，在人类膳食中，乳是所含营养成分最全、最适宜人消化吸收的全价营养食品，因此，人们还将乳汁称为“完全食物”[1−3]。羊乳营养丰富，具有风味独特、功能突出、易消化吸收等特点，被誉为“乳中之王”，在全球范围内都具有一定的市场规模[4−5]。然而，新鲜羊乳生产加工过程中，由于挤奶方式、冷藏不及时、器具清洗杀菌不彻底等因素不可避免地引起微生物污染，其中包括大量致病菌[6]，如大肠杆菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳链球菌（Streptococcus dysgalactiae）和乳房链球菌（Streptococcus uberis）等，这些均严重影响羊乳的品质，并对消费者的健康造成一定威胁。因此为保证羊乳及其制品的安全性及货架期的稳定性，促进羊乳产业的健康快速发展，羊乳中致病菌的杀灭至关重要[7−8]。

羊乳的传统杀菌方式主要以热处理为主，虽然杀菌效果明显，但会破坏羊乳的营养品质，风味损失严重，降低其稳定性[9−10]。超声杀菌技术是利用超声波产生的空化效应、机械效应和热效应等，能够使微生物减少或灭活，同时对产品品质无负面影响，被认为是一种很有前景的传统热杀菌替代技术[11]。因此，采用超声处理羊乳，有利于保证羊乳产品微生物安全、提高羊乳品质，对于研究开发高品质长货架期的非热杀菌羊乳具有重要意义。超声处理已用于果蔬汁[12]、奶酪[13]、牛奶[14]、酸奶[15]等的生产，然而有关超声处理对新鲜羊乳中的两种常见条件致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果方面的研究鲜有报道。本研究采用超声杀菌技术对新鲜羊乳进行杀菌处理，以期获得超声处理的最佳工艺条件，可以在保证杀菌效果的同时最大限度地保留羊乳原有的品质，为超声杀菌技术在羊乳生产加工的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊乳 西安市长安区周边牧场；金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希氏菌BNCC133264购于西安晶博生物科技有限公司；戊二醛、磷酸盐缓冲液（PBS）、营养肉汤培养基、平板计数培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）、Baird-Parker琼脂平板、脑心浸出液肉汤、兔血浆、营养琼脂小斜面、亚碲酸钾卵黄增菌液 北京奥博星生物技术有限责任公司。

SCIENTZ-950E超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；CU600A恒温水槽

上海福玛实验设备有限公司；GHP-9270隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；S-3400N扫描电子显微镜 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液及污染羊乳的制备 根据金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003与大肠埃希氏菌BNCC133264菌种附带的指导书分别将两种菌进行活化复壮，吸取200 μL上述菌液加入100 mL营养肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，再经过4500 r/min离心15 min，弃去上清液，菌体沉淀用PBS清洗两次后，采用比浊法[16]将金黄色葡萄球菌与大肠埃希氏菌混合菌液浓度调整为108CFU/mL，再按照1%（V/V）比例接种至原乳中，制成待测污染羊乳。

1.2.2 巴氏杀菌处理 取100 mL待测污染羊乳置于250 mL锥形瓶中，封口膜封住瓶口，巴氏杀菌条件为65 ℃水浴处理30 min，处理后迅速冷却至3~5 ℃，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 超声杀菌处理 将与恒温水槽连接的夹套烧杯用75%酒精浸泡30 min，然后用无菌去离子水冲洗3遍，再用羊乳润洗1次，取100 mL污染羊乳加至夹套烧杯，开启水浴循环使羊乳预热到设定温度，启动超声（超声频率为20~25 kHz），在不同功率、温度、时间下进行超声处理。超声过程中全程开启水浴循环，以保持恒定温度，超声停止后立即取样，立即测定大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落总数，大肠杆菌计数培养方法参考国家标准GB 4789.3-2016中的第二法，金黄色葡萄球菌计数培养方法参考国家标准GB 4789.10-2016中的第二法[17−18]，以仅预热未超声处理的污染羊乳作为对照，计算灭菌对数值Nk，每份样品重复测定3次。

式中：Nk，灭菌对数值；N，经灭菌处理后的条件致病菌菌落总数，CFU/mL；N0，对照组中的条件致病菌菌落总数，CFU/mL。

1.2.4 单因素实验设计 以灭菌对数值（Nk）为评价指标，研究超声功率、超声温度以及超声时间对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭菌效果，条件设置如下：恒定超声温度为50 ℃，超声时间为15 min，改变超声功率（0、100、200、300、400、500、600 W）；恒定超声功率为400 W，时间为15 min，设定不同的超声温度（20、30、40、45、50、60 ℃）；恒定超声功率为400 W，温度为50 ℃，设定不同的超声时间（0、10、15、20、25、30 min）。

1.2.5 响应面试验设计 在单因素实验结果的基础上，采用Box-Behnken模型，以超声功率（A）、超声温度（B）和超声时间（C）为自变量，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭菌对数值（Nk）为响应值，进行三因素三水平响应面试验，试验设计如表1。

表 1 Box-Behnken响应面设计试验因子与水平Table 1 Variables and levels in response surface design

1.2.6 菌落形态扫描电镜（SEM）观察 参考胡春辉等[19]的方法制备对照组、巴氏杀菌组和超声处理组的扫描电镜样品，采用S-3400N扫描电子显微镜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞菌体形态进行观察，其中超声处理组样品的制备条件为上述响应面分析所得的最佳条件。

1.2.7 不同处理下羊乳贮藏期微生物数量变化 将对照组（污染羊乳）、超声组（超声杀菌污染羊乳）和巴氏组（巴氏杀菌污染羊乳）分别置于4 ℃下贮存，并在0、1、7、14、17、21 d时取样对其中的菌落总数，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行计数，菌落总数计数培养方法参考国家标准GB 4789.2-2016[20]，每组处理重复测定3次。

1.3 数据处理

显著性分析采用DPS 8.0软件进行one-way ANOVA分析，结果以三次平行实验结果的平均值±标准差表示，置信水平为0.05；采用Origin 2018软件进行相关图表的绘制；利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

在超声温度为50 ℃，超声时间为15 min时，不同超声功率对污染羊乳中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的Nk值的影响如图1A。超声功率低于400 W时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间的杀灭效果无显著性差异，其中100~200 W内，两种菌株的Nk值持续增大，200~400 W内，Nk值变化相对缓慢。当超声功率由400 W增加至500 W，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的Nk值分别增加了38.6%、13.1%，当超声功率由500 W增至600 W时，两种菌株的Nk值涨幅开始降低，为避免声强过高产生声屏障减弱杀菌效果，因此选择超声功率500 W为中心试验点。此外，超声功率超过400 W后，大肠杆菌杀菌效果优于金黄色葡萄球菌，说明大肠杆菌对超声处理更为敏感。

在超声功率为400 W，超声时间为15 min时，不同超声温度对污染羊乳中的两种条件致病菌Nk值的影响如图1B。超声温度在低于40 ℃时，两种条件致病菌杀菌效果不明显，当超声温度再上升5 ℃时（45 ℃），两种条件致病菌的灭菌对数值迅速上升，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的Nk值分别增大了约15和40倍。可见超声温度对这两种致病菌的杀菌效果影响显著，这与林祎等[21]的研究结果一致。此外，当超声温度为50 ℃时，两种条件致病菌的灭菌对数值持续增加，而在50~60 ℃时，灭菌对数值增加趋势放缓，且温度持续升高会对羊乳中的风味成分、活性分子、营养物质造成损失[22−23]。因此在后续响应面试验设计中，选择50 ℃为中心试验点进行后续试验。

图 1 不同超声功率、温度和时间对新鲜羊乳中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭菌效果影响Fig.1 Effects of different ultrasonic power, temperature, and time on inactivation of E. coli and S. aureus in fresh goat milk

在超声功率为400 W，超声温度为50 ℃时，不同超声时间对污染羊乳中的两种条件致病菌Nk值的影响如图1C所示。随着超声时间延长，Nk值持续增大，表明超声处理时间对两种条件致病菌有一定的杀菌效果，而在超声处理30 min时Nk值仍然呈上升趋势，这可能是由于超声过程中会产生热效应，尽管在试验中已经循环通入冰水控制温度，但热效应与空化效应的协同作用仍然存在，此外，在试验设计时为确保Nk值结果可计算，细菌初始添加量和浓度较高，这也会一定程度地造成Nk持续增大。从超声效率方面考虑，降低超声时间过长造成的热效应，最大程度地保留羊乳中营养物质，提高生物利用率，因此选择超声时间20 min为中心试验点。

2.2 响应面试验设计与结果

2.2.1 响应面回归模型的建立与分析 本实验响应面试验设计与结果见表2，利用Design Expert8.0.6软件对表2中的数据进行多元回归拟合分析，得出大肠杆菌的灭菌对数值（y1）和金黄色葡萄球菌的灭菌对数值（y2）的二次回归模型，分别见公式（2）、（3）。

大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两个指标的ANOVA方差分析如表3所示，两个回归模型均具有高度的显著性（P<0.0001），失拟项均不显著（P>0.05），说明两模型拟合程度良好，所得回归方程较为可靠，可以用来分析和预测超声处理对羊乳中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活效果。

各因素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的Nk值影响程度的大小依次是B>C>A，其中超声温度B、时间C及B2对大肠杆菌Nk值的影响达到极显著水平（P<0.0001），A和C2达到较显著水平（P<0.01），A2及交互作用项AC、BC的影响显著（P<0.05）；温度B、时间C对金黄色葡萄球菌Nk值影响极显著（P<0.0001），B2影响较显著（P<0.01），A和C2影响显著（P<0.05）。

2.2.2 两因子间交互作用分析 图2为分析各因素间交互作用的响应面图，是由响应值与各试验因子构成的立体曲面图，显示的是当超声功率、温度和时间三因素任意一个取0水平时，其它两个因素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌响应值Nk的影响。等高线的形状可以反映因素间交互作用的显著性，等高线形状为圆形表明因素间交互作用不显著，为椭圆形则表明因素间交互作用显著[24]。

表 2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

表 3 多元方程方差分析表Table 3 ANOVA for the quadratic equation

图2 所示分别为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各因素间具有显著交互作用的响应面图，是由响应值与各试验因子构成的立体曲面图，显示的是当超声功率、温度和时间三因素两两交互作用于响应值Nk的影响。超声时间对大肠杆菌的影响较大，且AC、BC的交互作用显著（P<0.05）。此外，温度的曲面坡度比功率的曲面坡度更陡峭，与方差分析中超声处理温度对大肠杆菌Nk值的影响大于超声功率的结果一致（图2B、2C）。而金黄色葡萄球菌Nk值的温度-时间等高线图较为密集，BC之间的交互作用显著（P<0.05），此结果与方差分析结果一致。

2.2.3 最佳条件的预测及验证试验 美国FDA推荐的致病菌灭菌对数值为≥ 5[25]，因此，在超声功率、超声温度和超声时间尽可能小的情况下，保证大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的Nk值均大于5。通过软件运算所得的最优杀菌条件为：超声功率528.58 W、温度为59.64 °C、时间为29.64 min，考虑到实际操作，将最佳杀菌条件调整为：530 W、60 °C、30 min，并对此杀菌条件进行试验验证，得到该条件下的实测值为：大肠杆菌Nk值为7.55，金黄色葡萄球菌Nk值为6.53。与预测值（7.78、6.77）相比，误差均在5%以下，说明此优化条件下模型预测值与实际值高度拟合，证实该模型可以用来预测与分析超声处理对羊乳中大肠菌群和金黄色葡萄球菌的灭菌效果。

2.3 不同杀菌处理对菌体细胞表面形态的影响

未经处理的大肠杆菌表观形态如图3A所示，菌体细胞呈长杆状，形态圆润饱满。菌悬液经巴氏杀菌处理后（见图3B）表面出现皱缩现象，菌体细胞不再呈长杆状，出现严重内凹，部分菌体破裂，细胞内容物泄露。菌悬液经超声处理后（见图3C），出现大量的细胞碎片，菌体被严重破坏，内容物完全外泄，部分保留有完整细胞膜形状的菌体也已成为空壳，呈干瘪凹陷状。与巴氏杀菌处理相比，超声处理对大肠杆菌细胞表面形态影响更大，对菌体细胞的破坏性更强。超声处理时，由于其局部区域所受压力周期性改变可能导致共振，引起其双层磷脂分子振动频率和振幅加大，细胞膜穿孔甚至破裂，使胞内胞质流出，加速菌体死亡[26]。

未经处理的金黄色葡萄球菌表观形态如图4A所示，菌体细胞为圆形，排列呈葡萄球状，形态圆润饱满。菌悬液经巴氏杀菌处理后（图4B）菌体表面无明显裂痕，细胞内容物也无明显泄露，大部分菌体细胞开始出现还能聚集在一起。菌悬液经超声处理后（图4C)菌体开始出现部分皱缩，但基本维持原来的形状，细菌呈明显分散状态，不再保持葡萄球状。可

见超声处理对金黄色葡萄球菌的细胞表面结构影响最大，对菌体细胞膜的损伤最为严重，可能与细胞壁成分和结构的差异有关：大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌，其细胞壁外膜和细胞膜均容易被撕裂而产生孔洞，导致胞内胞质流出，加速细胞死亡；而金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，细胞壁较厚，为一层铰链立体网状的肽聚糖层，其刚性较强，且有磷壁酸分子对肽聚糖层进行加固，对细胞膜起到保护作用，因此其结构保持较为完整，死亡率较低。这与文献[27]报道的结果一致。

在4 °C下贮藏的对照组、超声组和巴氏组，其微生物指标的变化如表4所示。对照组原乳的初始菌落总数（TPC）、大肠杆菌菌落数（TCC）和金黄色葡萄球菌菌落数（S.aureus）已经超出了国家标准，贮藏过程中各菌落数均不断增加，第7 d时菌落总数、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数分别已达8.64、7.44和6.64 lg CFU/mL，远超国家标准，在后续的贮藏时间点就未再检测对照组的微生物指标。

与对照组原乳相比，巴氏杀菌对新鲜羊乳中菌落总数的杀菌率为46.41%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率达到100%，各微生物指标符合国家标准。在4 °C贮藏14 d后，羊乳中微生物不断增殖，菌落总数增长了46.5%，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌初次被检出，菌落数分别达到2.56和0.67 lg CFU/mL，已超出国家标准，这可能是由于巴氏杀菌处理对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞影响相对温和，虽然菌体细胞出现皱缩，粘连现象，但能保持基本形态，在羊乳中未失去增殖活性，在贮藏过程中再次被检出（图3B和4B）。巴杀乳贮藏21 d后，各微生物指标均明显增加，菌落总数、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数分别达到5.97、3.47和2.20 lg CFU/mL。

从表4可以看出，超声处理对新鲜羊乳中菌落总数的杀菌率为85.63%，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌率达到100%，各微生物指标均在国家标准要求范围内。在4 °C贮藏21 d后，超声乳的菌落总数为2.7 lg CFU/mL，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在贮藏期内均未被检出，仍符合国家标准。与巴杀乳相比，超声乳的杀菌效果更好，这可能与两种处理方式的灭菌机制不同有关。

3 讨论

目前超声处理在乳中的研究和应用主要是针对牛乳、奶酪等[28−29]，对新鲜羊乳的杀菌处理尚未见应用，同时超声处理对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液的杀菌效果已有所研究，但尚未研究超声处理对羊乳中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果。由于羊乳中所含的脂肪等物质可能对致病菌产生一定的保护作用[30]，因此研究超声处理对新鲜羊乳中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果影响是很有必要的。本研究表明，超声处理对新鲜羊乳中大肠杆菌的杀菌效果要强于金黄色葡萄球菌，这可能与大肠杆菌是革兰氏阴性菌，而金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌有关。超声处理牛奶的参数为400 W，63 ℃，30 min，可使牛奶在4 ℃下保存16 d以上[31]，声热复合处理液态奶（复原乳）的杀菌参数为400 W，50 ℃，10 min，货架期为10 d左右，比巴杀乳多3 d左右[32]。本研究确定的超声处理新鲜羊乳的工艺参数为：超声功率530 W，超声温度60 ℃，超声时间30 min，可延长货架期至21 d左右，明显优于其他乳及乳产品的处理工艺，可能是由于不同的乳产品具有不同的成分含量和组成，且超声处理方式和条件均存在一定差异。

表 4 不同杀菌处理对羊乳贮藏过程中微生物指标的影响（lg CFU/mL）Table 4 Effects of different sterilization treatments on the microbial indexes of goat milk during storage (lg CFU/mL)

超声处理主要是通过产生机械剪切力以及局部的高温和压力，也会在液体介质中产生分子震动从而产生破坏性的物理效应[11]，在食品加工过程中，超声处理有着微生物灭活、均质、脱气和重金属去除等多重作用[33−34]。尽管超声杀菌处理能够使羊乳满足商业无菌要求，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌效果也较理想，但单纯的超声处理难以达到满意的效果，必须要使样品控制在一定温度范围内。在预试验期间，研究发现热处理和超声处理联合杀菌，可以有效地缩短超声杀菌时间，并提高其杀菌效果。因此，在后续的研究过程中，可以缩短杀菌时间为生长点，最大化发挥超声本身的空化效应和热效应的联用效果，研究超声短时或瞬时杀菌的应用效果，保留羊乳中的生物活性物质，减少营养价值的损失。

4 结论

超声杀菌作为一种新型非热杀菌方式对新鲜羊乳具有较好的杀菌效果。本研究通过单因素实验和响应面优化分析确定了超声处理的最佳工艺条件为：超声功率530 W，超声温度60 ℃，超声时间30 min，在此条件下处理的羊乳在4 ℃下贮藏21 d后仍保持较低的菌落数，明显优于巴氏杀菌羊乳。因此超声处理可用于生产高品质长货架期的羊乳产品，可为羊乳的杀菌处理提供新的加工技术。