乡村自然发酵豆腐乳的真菌多样性研究

巫婷玉，徐芳玲 ，叶蔚歆，虞春华，马 嫚，陈 晔

（1.江西医学高等专科学校基础医学部，江西上饶 334000；2.九江学院药学与生命科学学院，江西九江 332000；3.广东省农业科学院，广东广州 510000）

豆腐乳是中国流传数千年的汉族传统民间美食，豆腐乳以它的口味鲜美、风味独特、质地细腻、营养丰富而著称，被称之为“东方奶酪”，是我国著名的传统发酵豆制调味品之一。发酵豆制品的整个生产过程被认为是一个开放的、传统的过程，整个发酵过程中有多种微生物共同参与，不同微生物所起的作用可能各不相同。

豆腐乳作为发酵食品，目前研究发现豆腐乳中真菌有毛霉属（Mucor）[1−2]、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、根霉属（Rhizopus）[3]、地霉属（Geotrichum）、镰刀孢属（Fusarium）、毛孢子菌属（Trichosporon）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、酵母属（Saccharomyces）、耶罗维亚酵母属（Yarrowia）等微生物[4−6]；微生物在豆腐乳的生产、挥发性风味、品质等方面具有影响，国内外不同地方[7−9]以及不同风味的豆腐乳中微生物多样性研究[10−12]表明，豆腐乳中具有丰富的真菌资源，如低盐[13−14]、红豆腐乳[15]、传统发酵的豆腐乳[16−17]中的真菌资源均很丰富。

上饶位于江西省东北部，气候温湿，适合真菌的生存。由于当地的风俗习惯，每年春节将近家家户户都会制作豆腐乳。相对于工厂里具有严格的安全管理，家庭自制发酵豆腐乳具有更高的危害性，由于自制豆腐乳开放式的制作环境，豆腐乳中其它杂霉菌和细菌存在的几率很高。这些霉菌的存在对于豆腐乳风味的形成可能具有一定的有益作用，同时也可能是有害菌株，在发酵过程中产毒，造成多种微量毒素共存的现象[18−22]。因此，为了让百姓了解自制发酵豆腐乳的危害性，更好地改善自制豆腐乳的品质，本文以自然发酵豆腐乳为材料，采用稀释平板培养方法，结合形态特征和LSU序列测序进行菌株鉴定探究上饶不同地区豆腐乳真菌的多样性。研究结果将有助于进一步了解家庭自制自然发酵豆腐乳真菌毒素的检测，为家庭自制豆腐乳安全性提供科学的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

自然发酵豆腐乳 来自江西上饶市的八个乡村；分离培养基 虎红培养基（蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、琼脂19 g、孟加拉红0.033 g、氯霉素0.1 g、蒸馏水1000 mL）；纯化、保种培养基 PDA培养基。

LT302电子天平、DYY-2C型电泳仪 北京市六一仪器厂；紫外分析仪、HH-4数显恒温水浴锅、基因扩增仪 上海启前电子科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料采集和处理 于2018年4月分别在江西上饶市八个乡村进行了自然发酵豆腐乳样本采集（具体采样地点为：A：婺源县溪头乡呈川村；B：广丰区洋口镇；C：铅山县紫溪乡文山村；D：玉山县樟村镇；E：德兴市红山生活区；F：上饶县田墩镇；G铅山县石塘周边；H：广丰区小康城安利小区。在文中图表用不同英文字母来表示不同采样点）。在每个采样点分别采集3家自然发酵豆腐乳放入无菌瓶中（每瓶150 g），并用无菌自封袋密封带回实验室于4 ℃保存，对样品进行处理培养。

1.2.2 真菌分离纯化 采用稀释涂布平板法。样品稀释液的制备：准确称取待测样品l0 g，放入研钵中，加入90 mL蒸馏水，进行研磨，使微生物细胞分散，再在虎红培养基上进行涂布，将平板倒置，进行标号，放入25 ℃恒温培养箱培养5~7 d，每天观察。做三个平行实验，每一个平行实验中每个稀释浓度涂布五个平板。

当培养基上长出菌丝后，通过不同菌落的形态特征进行区分，用无菌接种针分别挑取不同菌落的菌丝接到PDA培养基上，继续25 ℃恒温培养箱中培养3~5 d，进行纯化培养，直到获得单一的菌种[23]。纯化得到的菌株进行分离鉴定，并采用甘油管保藏法置于−20 ℃于保存。

1.2.3 真菌的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定 根据菌落的形态、颜色、菌丝和产孢器结构的形态查阅《真菌鉴定手册》[24]、Barnett & hunter（1998）和Seifert et al.（2011）的分类系统鉴定到属。

1.2.3.2 分子生物学鉴定 根据菌落的培养特征及微观特征进行形态型的划分合并，通过选取具有代表性的形态型菌株，分别刮取在PDA上培养成熟的菌丝，利用氯化苄法提取DNA[25]。采用真菌引物LR0R（5’-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3’）和LR5（5’-TTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3’）对菌株进行PCR扩增LSU片段[26]，获得的扩增产物送北京擎科生物科技有限公司进行序列测定。测得序列经峰图检查并在NCBI中进行同源性比对[27]。确保序列准确性后，将本研究获得序列和从GenBank数据库中下载的相关序列利用MEGA 10.1软件构建系统发育树。

1.2.4 实验数据公式

1.2.4.1 菌落总数（colonies number）的计算

式中：C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；m表示涂布平板时所用豆腐乳的质量，g；M表示稀释倍数。

1.2.4.2 分离频率（isolation frequency，IF）的计算

1.2.4.3 Shannon-Wiener指数（H）的计算

式中：pi表示为种i真菌菌株数目与全部真菌菌株数目的比值。

1.2.4.4 Jaccard相似性指数（Cj）的计算[28]

式中：a表示一个地区豆腐乳分离的真菌的属数；b表示另一个地区豆腐乳分离的真菌的属数；c表示两个地区豆腐乳具有的相同真菌属数；Cj表示两个地区豆腐乳之间真菌的属组成的相似程度。

1.3 数据处理

运用Origin75汉化版软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 豆腐乳中菌落数的比较

豆腐乳中每样品中的菌落数（表1），豆腐乳中的真菌数量较多。在同一稀释浓度下，不同的地区的豆腐乳中真菌数有较大的差异，在稀释浓度为10−3时，铅山县紫溪乡文山村、广丰区洋口镇、婺源县溪头乡呈川村每克样品中的菌落数明显高于其他五个地区；在稀释浓度为10−4时，铅山县紫溪乡文山村、上饶县田墩镇、广丰区小康城安利小区、婺源县溪头乡呈川村的每克样品中的菌落数明显高于其他四个地区；在稀释浓度为10−5时，铅山县紫溪乡文山村、广丰区洋口镇、铅山县石塘周边的每克样品中的菌落数明显高于其他五个地区；说明铅山县紫溪乡文山村、广丰区洋口镇、铅山县石塘周边三个地区的菌株丰富度较高。

表 1 每克样品中的菌落数Table 1 Number of colonies per gram of sample

2.2 豆腐乳中真菌主要类群组成

从上饶市八个地区自制豆腐乳样品中共分离227个菌株，根据形态特征，形态型菌株LSU序列的相似性比较和分子发育分析将227株菌株划分Aspergillus、Penicillium、Talaromyces等26个分类单元（表2）。从属级水平的分离频率来看，以Penicillium（29.04%）、Aspergillus（24.65%）、Talaromyces（22.88%）、Fusarium（10.57%）为优势菌群；同时可知Penicillium为婺源县溪头乡呈川村、铅山县石塘周边、广丰区洋口镇的共同优势菌群，Talaromyces为广丰区小康城安利小区和上饶县田墩镇的共同优势菌群，而德兴市红山生活区的优势菌群为Penicillium和Aspergillum，铅山县紫溪乡文山村的优势菌群为Aspergillus，玉山县樟树镇的优势菌群为Fusarium。

表 2 上饶地区自制豆腐乳真菌菌群组成Table 2 Composition of fermented soybean curd fungus in Shangrao area

从种级水平的分离频率来看：在八个地区中，以Aspergillus niger（12.77%）、Penicillium pulvillorum（11.00%）、Talaromyces albobiverticillius（10.12%）为优势菌群；在各个地区的优势类群也有一定的差异，在婺源县溪头乡呈川村以Penicillium pulvillorum（3.08%）、Penicillium citrimum（2.64%）、Fusarium oxysporum（1.76%）为优势菌群，在广丰区洋口镇以Penicillium citrimum（3.96%）、Talaromyces albobiverticillius（2.20%）、Aspergillus niger（2.20%）为优势菌群，在铅山县紫溪乡文山村以Aspergillus niger（4.41%）、Penicillium pulvillorum（3.52%）、Talaromyces amestolkiae（2.20%）为优势菌群，在玉山县樟村镇 以Fusarium flocciferum（4.41%）、Aspergillus restrictus（2.64%）、Fusarium oxysporum（1.76%）、Bionectriasp.（1.76%）为优势菌群，在德兴市红山生活区以Penicillium brasilianum（1.32%）、Aspergillus flavus（0.88%）、Fusarium tricinctum（0.88%）优势菌群，在上饶县田墩镇以Penicillium brasilianum（2.64%）、Talaromyces verruculosus（2.64%）、Aspergillus restrictu（2.20%）为优势菌群，在铅山县石塘周边以Aspergillus niger（2.20%）、Penicillium pulvillorum（2.20%）、Penicillium brasilianum（1.76%）、Fusarium flocciferum（1.76%）为优势菌群，在广丰区小康城安利小区以Talaromyces albobiverticillius（2.20%）、Bionectriasp.（1.76%）、Talaromyces allahabadensis（1.32%）为优势菌群；其中Aspergillus novoparasiticus、Trematosphaeria biappendiculate为 婺 源县溪头乡呈川村特有菌株，Fungalsp.为铅山县紫溪乡文山村特有菌株，Penicillium oxalicum、Penicillium mariae-crucis、Penicilliumsp.、Talaomyces aculeatus为玉山县樟村镇特有菌株，Aspergillus flavusvar、Fusarium tricinctum、Meyerozyma guilliermondii为德兴市红山生活区特有菌株，Talaromyces purpureogenus为上饶县田墩镇特有菌株，Penicil-lium simplicissimum、Penicillium mariae-crucis、Talaromyces allahabadensis为广丰区小康城安利小区特有菌株，说明每个地区的环境不同导致了菌落的差异性。

2.3 系统发育树的构建

从图1中可以看出明显分为三个进化分支，其自展值各为99%；其中菌株D011与Meyerozyma guilliermondiiKY108543单独划为一支，两者的自展值为99%，具有较高的相似性。菌株D001、Y007、Y036聚集在一支归属于Fusarium，另外菌株Y042与Bionectriasp. DQ327624.1具有99%的自展值；Aspergillus、Penicillium、Talaromyces、Trematosphaeria划为一支，均属于散囊菌目的丝孢发菌科mitosporicTrichocomaceae；其中菌株R007、R001、Y009、Y019、1K004以及W009聚集为一支归属于Talaromyces，菌株1K004与Talaromyces albobiverticilliusMH869906具有99%的自展值，较高的相似性；菌株D004、Q026、D005、W041聚集为一支归属于Aspergillus，该四株菌种为Aspergillus的可信度较高，菌株G038与Aspergillus restrictusJF922028的自展值达到99%；菌株2Y019、K009、K006、Y014、T018等聚集为一支，归属于Penicillium，其中菌株G033与Penicillium citrinumMH665234的自展值为99%。

2.4 豆腐乳中真菌相似性及多样性分析

2.4.1 上饶地区豆腐乳中真菌菌群组成的多样性从Shannon-Wiener指数（H）来看（图2），铅山县石塘周边（H=1.92）>广丰区小康城安利小区（H=1.57）>婺源县溪头乡呈川村（H=1.56）>玉山县樟村镇（H=1.50）>广丰区洋口镇（H=1.42）>铅山县紫溪乡文山村（H=1.28）>上饶县田墩镇（H=1.26）>德兴市红山生活区（H=0.74），可以看出铅山县石塘周边的豆腐乳中的真菌多样性较高，而德兴市红山生活区的豆腐乳中的真菌多样性是八个地区中最低的，该地区的豆腐乳中的真菌种类相当于其他七个地区更单调。

图 1 基于LSU基因序列构建的豆腐乳菌株的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of soybean curd strain based on LSU gene sequence

图 2 不同地区豆腐乳真菌的多样性指数Fig.2 Diversity index of fermented soybean curd fungi in different regions

2.4.2 上饶地区豆腐乳中真菌菌群组成的相似性从相似性系数来看（表3），铅山县石塘周边和广丰区小康城安利小区豆腐乳的真菌的相似性系数（Cj）为1.00，而铅山县紫溪乡文山村和玉山县樟村镇中豆腐乳的真菌的相似性系数（Cj）为0.29，并且Fungal只出现在铅山县紫溪乡文山村、Trematosphaeria只出现在婺源县溪头乡呈川村、Meyerozyma只出现在德兴市红山生活区，说明铅山县紫溪乡文山村与玉山县樟树村镇的豆腐乳中的真菌相似性不高，具有一定的差异性，铅山县石塘周边和广丰小康城安利小区的豆腐乳中的真菌的属相似度很高，并且以上一些菌株只在个别地区存在，因此八个地区豆腐乳中的真菌类群存在一定的差异性和专一性。

3 结论

本研究从上饶市中八个地区豆腐乳中共分离了227个菌株，鉴定出26个分类单元：Penicillium、Aspergillus、Talaromyces、Fusarium等9个 属26种。研究发现不同地区豆腐乳中的真菌种群数量和群落结构存在较大差异性与专一性，个别地区具有特殊的菌株，如婺源县溪头乡呈川村豆腐乳中的真菌（Aspergillus novoparasiticus、Trematosphaeria biappendiculate）为该地区的特有菌株，Fungalsp.为铅山县紫溪乡文山村豆腐乳中的特有菌株，Penicillium oxalicum、Penicillium mariae-crucis、Penicilliumsp.、Talaromyces aculeatus为玉山县樟村镇豆腐乳中的特有菌株。八个地区豆腐乳中分离得到的菌株多样性系数和相似性系数结果表明，铅山县石塘周边的豆腐乳真菌多样性系数（H=1.92）最高，该地环境中能侵入豆腐乳的真菌相当于其他地区种类更多；而德兴市红山生活区的豆腐乳真菌为多样性系数（H=0.74），是八个地区中最低，该地豆腐乳中的真菌比其他七个地区种类更少；由相似性系数分析可知，铅山县石塘周边和广丰区小康城安利小区豆腐乳的真菌的相似性系数（Cj）为1.00，而铅山县紫溪乡文山村和玉山县樟村镇中豆腐乳的真菌的相似性系数（Cj）为0.29，不同两个地区的菌株相似性系数不相同，说明不同地区自然发酵豆腐乳的真菌具有一定的差异性。影响八个地区豆腐乳中真菌多样性的因素很多，如温度、湿度、季节、覆盖的稻草环境因素等[29−30]，而有关影响豆腐乳中真菌多样性的具体机制有待进一步探究。

表 3 不同地区豆腐乳真菌的相似性指数Table 3 Similarity index of soybean curd fungi in different regions