miR-135b和LZTS1 mRNA HE4 mRNA在卵巢癌中的表达及临床意义

章 品，冯国琴，程文凤，章 阳

(1.湖北省老河口市第一医院妇产科，湖北 老河口 441800 2.湖北文理学院附属医院/湖北省襄阳市中心医院肿瘤科，湖北 襄 阳 441021)

卵巢癌是一种常见的女性生殖器恶性肿瘤，由于早期缺乏典型症状及有效筛查手段，多数卵巢癌患者就诊时已属Ⅲ期、Ⅳ期，5年生存率低至30%[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)作为一类可调控基因表达的RNA小分子，参与并影响多种肿瘤发展过程，是诊治及评估肿瘤预后的潜在生物学指标[2]。汪萍萍等[3]研究发现微小RNA-135b(miR-135b)在卵巢上皮癌中表达上调，与肿瘤侵袭、转移及临床分期相关，miR-135b可能在卵巢上皮癌中发挥促癌作用。亮氨酸拉链肿瘤抑制基因1(LZTS1)是一种潜在抑癌基因，其在肝细胞癌中可通过损害磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路发挥抑癌作用，LZTS1有望成为肝细胞癌的诊治靶标[4]。人附睾蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)在正常组织中含量较低，但其在卵巢癌中表达升高，有利于卵巢癌的诊断和预后评估[5]。但miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA联合诊断卵巢癌的研究尚未发现相关报道。基于此，本研究通过初步观察miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA在卵巢癌中的表达情况，旨在探究miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA对卵巢癌的诊断效能。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2018年1月至2020年11月本院接收的卵巢癌患者56例，收集手术切除的卵巢癌组织标本(卵巢癌组)及对应癌旁组织(癌旁组)进行研究。其中年龄38～65岁，平均年龄(50.09±10.32)岁，<50岁18例，≥50岁38例；浆液性囊腺癌39例，黏液性腺癌17例；低、中分化40例，高分化16例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期34例；淋巴结转移30例，无淋巴结转移26例。诊断标准：参考《卵巢癌诊疗规范(2018年版)》中的相关内容进行诊断[6]。纳入标准：①所有患者均经手术病理组织确诊为卵巢癌；②患者为首次就诊；③术前未接受放疗、化疗或其它辅助治疗。排除标准：①病理诊断不明确、病历资料不全者；②合并其他类型肿瘤者；③合并免疫功能缺陷、结缔组织疾病、严重心肝肾功能不全者。所有患者自愿参与本项研究。本研究获得本院伦理委员会审核、批准。

1.2主要试剂与仪器:TRIzol试剂(货号：15596-025)购自上海伟进生物科技有限公司，反转录试剂盒(货号：XY-411A)购自上海信裕生物科技有限公司，荧光定量PCR试剂盒(2×SYBR Green qPCR Master Mix)(货号：N/A-632)购自上海联硕生物科技有限公司。紫外分光光度计(型号：NanoDrop One/One c)购自北京龙跃生物科技发展有限公司，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(型号：MiniAmp)购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.3方 法

1.3.1标本采集:行手术切除的癌组织标本及癌旁组织标本迅速置于液氮罐中，一段时间后，放入-80℃冰箱中冻存。

1.3.2qRT-PCR法检测miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA水平:取出-80℃冰箱中保存的组织标本，研磨，采用TRIzol法抽提组织标本的总RNA，以紫外分光光度计测定抽提RNA在波长260nm、280nm的吸光度(A)，以A260/A280比值在1.8～2.0之间的标本进行后续实验。根据反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。参照2×SYBR Green qPCR Master Mix配制相应反应体系，将cDNA进行扩增、检测。miR-135b以U6为内参，LZTS1 mRNA、HE4 mRNA以GAPDH为内参，引物由华大公司合成，对应引物序列见表1，miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA的表达水平以2-△△CT法计算。

表1 miR-135b LZTS1 mRNA HE4 mRNA及对应内参U6 GAPDH的引物序列

2 结 果

2.1癌旁组和卵巢癌组miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表达水平比较:卵巢癌组miR-135b、HE4 mRNA表达水平均明显高于癌旁组(P均<0.05)，LZTS1 mRNA表达水平明显低于癌旁组(P<0.05)。见表2。

表2 癌旁组和卵巢癌组miR-135b LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表达水平比较

2.2卵巢癌组织中miR-135b表达水平与卵巢癌临床病理特征的关系:以卵巢癌组织中miR-135b表达水平均值1.65为界限，其中miR-135b表达水平低于1.65的患者为miR-135b低表达组(n=22)，高于1.65的患者为miR-135b高表达组(n=34)。结果显示，卵巢癌组织中miR-135b表达水平与年龄、病理类型无关(P均>0.05)，与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关(P均<0.05)。见表3。

表3 卵巢癌组癌组织中miR-135b表达水平与卵巢癌临床病理特征的关系n(%)

2.3卵巢癌组织中LZTS1 mRNA表达水平与卵巢癌临床病理特征的关系:以卵巢癌组织中LZTS1 mRNA表达水平均值0.72为界限，其中LZTS1 mRNA表达水平低于0.72的患者为LZTS1 mRNA低表达组(n=29)，高于0.72的患者为LZTS1 mRNA高表达组(n=27)。结果显示，卵巢癌组织中LZTS1 mRNA表达水平与年龄、病理类型无关(P均>0.05)，与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关(P均<0.05)。见表4。

表4 卵巢癌组癌组织中LZTS1 mRNA表达水平与卵巢癌临床病理特征的关系n(%)

2.4卵巢癌组织中HE4 mRNA表达水平与卵巢癌临床病理特征的关系:以卵巢癌组织中HE4 mRNA表达水平均值1.57为界限，其中HE4 mRNA表达水平低于1.57的患者为HE4 mRNA低表达组(n=24)，高于1.57的患者为HE4 mRNA高表达组(n=32)。结果显示，卵巢癌组织中HE4 mRNA表达水平与年龄、病理类型无关(P均>0.05)，与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关(P均<0.05)。见表5。

表5 卵巢癌组癌组织中HE4 mRNA表达水平与卵巢癌临床病理特征的关系n(%)

图1 miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表达水平对卵巢癌的诊断价值

2.5miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表达水平对卵巢癌的诊断价值:miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA对卵巢癌诊断的曲线下面积(AUC)分别为0.781(95%CI：0.693～0.869)、0.755(95%CI：0.665～0.844)、0.773(95%CI：0.685～0.862)，灵敏度分别为74.5%、76.4%、72.7%，特异度分别为77.2%、72.9%、77.2%，截断值分别为1.25、0.87、1.20；三者联合对卵巢癌诊断的AUC为0.943(95%CI：0.904～0.982)，其灵敏度、特异度分别为90.9%、84.2%。见图1。

3 讨 论

卵巢癌是女性恶性肿瘤之一，位于盆腔深部，多数患者早期无明显症状，易引起漏诊，严重影响女性患者生存情况[7]。因此，寻找可有效诊断卵巢癌的手段，对改善患者预后具有积极意义。

miRNA参与并调控细胞增殖、转移、凋亡等过程，与卵巢癌等多种肿瘤关系密切[8]。已有研究表明miR-135b在子宫内膜癌中呈高表达，其可通过下调靶基因叉头框转录因子O亚族1(FOXO1)，从而促进子宫内膜癌的发生和发展[9]。Lv等[10]也报道miR-135b在乳腺癌中过表达，通过直接靶向大肿瘤抑制激酶2而调控Hippo信号，进而促进乳腺癌的形成与发展。以上研究表明，miR-135b在两种女性肿瘤中表达上调，其有望作为监测两种女性恶性肿瘤发生发展的生物学分子指标。本研究显示，卵巢癌组miR-135b表达水平明显高于癌旁组，提示miR-135b可能与卵巢癌发展过程有关。分析其可能原因，miR-135b通过作用于特定靶基因进而调控信号传导，从而影响卵巢癌的发展进程。

LZTS1 mRNA在多种肿瘤细胞中表达失调， 其可能在许多肿瘤形成及发展过程中起重要作用[11]。有关研究显示，LZTS1 mRNA在甲状腺乳头状癌临床Ⅰ、Ⅱ期的异常表达率明显高于Ⅲ、Ⅳ期，LZTS1 mRNA异常表达可能与甲状腺乳头状癌发生、发展关系密切，其对诊断甲状腺乳头状癌有一定辅助作用[12]。此外，Olasz等[13]发现LZTS1 mRNA在皮肤鳞状细胞癌中异常下调，LZTS1 mRNA受miR-135b负调控，其可能影响皮肤鳞状细胞癌病变过程。本研究显示，卵巢癌组LZTS1 mRNA表达水平明显低于癌旁组，与其在皮肤鳞状细胞癌中的趋势一致[13]，提示LZTS1 mRNA可能在卵巢癌形成发展进程中发挥一定作用，其具有诊断卵巢癌的潜在价值，推测LZTS1 mRNA通过受靶基因miRNA调控，进而在卵巢癌发展进程中发挥抑癌作用。

HE4 mRNA在天然免疫、精子成熟及肿瘤增殖过程中发挥着广泛的生物学功能[14]。研究发现，HE4 mRNA在上皮性卵巢癌中呈高表达，其与上皮性卵巢癌患者预后相关，可辅助诊断上皮性卵巢癌[15]。本研究显示卵巢癌组HE4 mRNA表达水平明显高于癌旁组，与Luo等[15]研究趋势相符，提示HE4 mRNA可能参与并影响卵巢癌发展过程。HE4 mRNA可能在卵巢癌发展病程中发挥促癌作用。

此外，本研究显示，卵巢癌组织中miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期及淋巴结转移相关，进一步提示miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA与卵巢癌病情进展相关，三者可能在卵巢癌进展中发挥促癌或抑癌作用。本研究还探讨了卵巢组织miR-135b、LZTS1 mRNA及HE4 mRNA表达水平对卵巢癌的诊断价值，结果显示，卵巢组织miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA诊断卵巢癌的AUC分别为0.781、0.755、0.773，当卵巢组织miR-135b表达水平高于1.25或LZTS1 mRNA表达水平低于0.87或HE4 mRNA表达水平高于1.20，卵巢癌发生率增高，提示miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA对诊断卵巢癌具有一定潜在价值；卵巢组织miR-135b、LZTS1 mRNA、HE4 mRNA联合诊断卵巢癌的价值高于单独检测价值，三者联合可有效提高卵巢癌的诊断效能。

综上所述，卵巢癌患者癌组织中miR-135b、HE4 mRNA表达上调，LZTS1 mRNA表达下调，三者均可能参与并影响卵巢癌发生发展过程，可有效提高预测卵巢癌的价值，具有筛选卵巢癌的辅助作用。