一株野生裂褶菌的分离鉴定和驯化培养初探

孙 波 周洪英 赵会长 王卓仁 刘启燕 吴洪丽

（湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北武汉430064）

裂褶菌Schizophyllum commune，别名白参、树花，属担子菌纲、伞菌目、裂褶菌科、裂褶菌属。裂褶菌是一种食药用菌，有镇静，治疗神经衰弱、精神不振、头昏耳鸣、虚汗，缓解运动疲劳的作用[1-2]。笔者对一株野生裂褶菌进行分离鉴定培养，并探索该菌株驯化培养条件，为进一步研究开发该菌株提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株为2020年6月笔者在湖北省武汉市江滩上的樱花树干上采集的野生裂褶菌（Schizophyllumsp.）子实体。

1.2 主要仪器与试剂

Thermo Sorvall Biofuge Primo R型高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司），TaKaRa TP600型PCR仪（Taka ra生物株式会社），NanoDrop2000超微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司），ABI3730-XL型测序仪（Applied Biosystems美国应用生物系统公司），AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（爱思进生物技术有限公司），Taq DNA聚合酶（上海桑尼生物科技有限公司），DNA marker（Taka ra生物株式会社），葡萄糖、蛋白胨、琼脂为国产分析纯。

1.3 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂18～20 g，水1 000 mL，pH自然。

马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 000 mL，pH自然。

桑枝屑培养基：桑枝屑80%，麸皮18%，糖1%，石膏1%，料含水量60%～65%。采用规格为14 cm×26 cm×0.005 cm的聚丙烯折角袋装料，用套环防水盖封口，121℃灭菌2 h。

1.4 试验方法

1.4.1 野生裂褶菌菌株分离鉴定

取野生裂褶菌子实体，无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干水，将菌褶向下放在无菌玻璃平板上，26℃静置24～48 h。有大量孢子落下形成白色孢子印后，取孢子接种到PDA平板培养基上，26℃培养，待孢子萌发得到纯培养菌株后转接至PDA斜面培养基中，26℃培养至菌丝满管，置4℃冰箱保存备用[3]。

取纯培养菌株，采用内转录间隔区序列（ITS）分析对其进行分子鉴定[4]。提取真菌基因组DNA，进行PCR扩增，引物设计，ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收。取纯化后的PCR产物，用ABI3730-XL测序仪进行DNA测序。用NCBIBlast程序将拼接后的序列文件与美国国立生物技术信息中心（NCBI）核酸数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息。

1.4.2 驯化前后裂褶菌菌株菌丝生长速度测定

取纯培养菌株和驯化培养7代菌株，分别接种至PDA平板中央，26℃培养，待菌块萌发并长出约0.5 cm后，在菌落边缘划线（起始线），继续培养10 d，划终止线，测量起始线与终止线间的距离。菌丝生长速度（mm/d）=起始线与终止线间的距离/菌丝生长的时间。

1.4.3 野生裂褶菌驯化培养及出菇试验

用桑枝屑培养基进行裂褶菌菌株驯化培养。取纯培养菌株接入桑枝屑培养基中，26℃避光培养，测定记录菌丝生长速度和浓密程度，再取菌丝生长前端接入下一级培养基中，再测定记录菌丝生长速度和浓密程度，以此类推，分别取各级菌株进行驯化培养。

取驯化7代后的菌株接种至马铃薯葡萄糖液体培养基（250 mL三角瓶装液量150 mL）中，26℃、150 r/min摇床培养10 d，发酵液5 000 r/min离心收集菌丝体，用水清洗3次，烘干称重得菌丝体生物量。

取驯化7代后菌株接入桑枝屑料袋，26℃培养30～35 d，菌丝满袋后，再培养7～10 d进行出菇管理，10～15 d后可采收[5]。记录子实体单重，计算生物学效率。

2 结果与分析

2.1 野生裂褶菌菌株分离鉴定结果

在活的樱花树上采集的野生裂褶菌子实体，丛生，颜色灰白色，单片呈扇形（10 mm×17 mm），根据形态初步鉴定为裂褶菌属（Schizophyllum），如图1。采用ITS分析法对孢子分离法得到的纯培养菌株进行分子鉴定，比对结果显示，Schizophyllum commune与待测物种序列最大相似度为99.83%。

图1 野生裂褶菌子实体

2.2 野生裂褶菌驯化培养前后菌丝生长比较结果

野生裂褶菌未经驯化前，在平板上生长菌丝呈棉絮状、稀疏，菌落不规则，可见部分菌丝扭结形成菌核（图2），菌丝向周围生长扩散的速度较慢，菌丝平均长速仅2 mm/d。驯化培养7代后，菌丝状态与驯化前差异明显，菌丝浓密，呈棉絮状，菌苔增厚，菌丝密度增大，未见菌丝扭结形成菌核（图3），菌丝平均生长速度达3.1 mm/d。

图2 驯化前野生裂褶菌菌丝生长状态

图3 驯化7代后野生裂褶菌菌丝生长状态

2.3 驯化培养及出菇试验结果

由图4可知，随着菌株转接次数的增加，菌丝在桑枝屑培养基中生长逐渐浓密，平均生长速度呈加快趋势，最终（驯化7代）为7.0～7.3 mm/d。驯化7代的裂褶菌菌株接入液体培养基中，26℃，150 r/min摇床培养10 d，菌丝体生物量达17.3 g/L。驯化7代后的裂褶菌菌株袋料栽培结果，可采收2潮子实体，2潮子实体的外观形态无明显差异，第1潮、第2潮平均单菇重分别为20.7 g、12.9 g，生物学效率为16.8%。

图4 驯化后野生裂褶菌菌株在桑枝屑培养基中菌丝生长速度

图5 驯化7代后栽培的子实体

3 小结与讨论

采用孢子分离法分离培养活樱花树上采集的野生裂褶菌，得到纯培养菌株，经ITS序列分析，鉴定为Schizophyllum commune。采用桑枝屑培养基连续驯化培养表明，转接次数增加，菌丝生长逐渐浓密，平均生长速度加快，生物学效率达16.8%。

试验只进行了野生裂褶菌分离鉴定及初步驯化培养，并未对其液体培养基配方和培养条件等进行优化，今后可进一步细化培养条件及出菇管理，为提高生物学效率和菌丝体生物量奠定基础。