基于网络药理学的桃红四物汤治疗骨关节炎作用机制研究*

吴磊磊 张俊忠

(1.山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院运动损伤骨科，山东 济南 250014)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)指由多种因素引起关节软骨纤维化、皲裂、溃疡、脱失而导致的关节疾病，发病率约为2%～6%，以中老年患者多见，女性多于男性[1-2]。OA在40岁人群的发病率为10%～17%，60岁以上则达50%，而在75岁以上人群，患病率可达80%，最终致残率高达53%，随着医疗条件改善和人类寿命的延长，OA成为影响老年人生活质量和健康状态的重要疾病之一[3]。主要病变是关节软骨的退行性变和继发性骨质增生，好发于负重大、活动多的关节，如脊柱、膝、髋关节等。临床表现为疼痛、活动障碍、僵硬、肿大畸形等。发病因素目前尚不明确，有学者认为主要与高龄、肥胖、关节疲劳、机械损伤、寒冷、过度运动和遗传等相关[4]。

OA在中医上属于“骨痹”“痹证”范畴，最早可见于《黄帝内经》，《素问·长刺节论篇》：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”骨关节炎在国内，中医药治疗骨关节炎仍是优先选择手段[5]。中医药治疗骨关节炎具有疗效显著、副作用小、费用低等优势[6]。

桃红四物汤出自《医宗金鉴》，由桃仁、红花、川芎、当归、熟地黄、白芍六味药组成，具有祛瘀、行气、活血功效，方中以桃仁、红花为君，主活血化瘀之功；熟地黄、当归性甘温，佐以滋阴养肝之效；白芍养血和营，以增强补血之力；川芎活血行气、调畅气血，加强活血。全方配伍得当，药性和缓，补血而不滞血，和血而不伤血。

网络药理学(Network pharmacology)由Hopkins在2007年提出的一门新兴学科，通过系统观察药物对疾病的干预和影响，预测药物的致病作用机制，评估药物的有效性等[7]，为药物的研发和应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1桃红四物汤相关靶点筛选及药物-成分-靶点网络构建 通过中药系统药理数据库和分析平台[8](TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)分别以“桃仁”、“红花”、“当归”、“川芎”、“熟地黄”、“白芍”为关键词检索桃红四物汤的成分，根据口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30和类药性(Drug likeness，DL)≥0.18为ADME属性值对活性成分进行筛选，得到6个药物中所含有的成分，并利用化学成分进行检索，得到相对应的蛋白质靶点。筛选结束后，运用Uniprot数据库[9](https://www.uniprot.org/)查询并规范相对应的官方基因名称(official gene symbol)，合并并删除重复值。运用Cytoscape 3.7.2软件[10]构建“药物-成分-靶点”网络，利用Cytoscape 3.7.2软件中的“Network Analyzer”进行拓扑属性分析。

1.2OA相关靶点预测及韦恩图制作 通过GeneCards数据库[11](https://www.genecards.org/Guide/Publications)、TTD数据库[12](http://db.idrblab.net/ttd/)以“Osteoarthritis”为关键词检索与OA相关的疾病靶点，合并靶点并删除重复值，建立OA相关疾病基因靶点数据集。通过Venny在线制作平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将药物基因靶点和疾病基因靶点相映射，绘制韦恩图并获得药物-疾病交集基因靶点。

1.3PPI网络的构建与分析 将得到的药物-疾病交集基因靶点导入到STRING 11.0数据库[13](https://string-db.org/)中构建蛋白相互作用网络，设置物种种类为“Home sapiens”(人类)，最低互相作用阈值设置为“high confidence”(>0.700),隐藏网络中未连接的节点，其余均为默认值，得到PPI网络图和TSV文件，将TSV文件导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建PPI网络，进行拓扑属性分析，筛选核心靶点信息。

1.4靶点功能与通路的富集分析 为了进一步了解药物-疾病的潜在治疗基因靶点的功能和在信号通路中发挥的作用，将交集基因靶点导入DAVID数据库[14](https://david.ncifcrf.gov/)，物种种类设置为“Home sapiens”(人类)，设置P<0.05，进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。GO分析选择细胞组分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物过程(biological process，BP)。利用Omicshare在线云平台绘制GO富集分析分类柱状图、气泡图和KEGG信号通路富集分析气泡图。

2 结果

2.1桃红四物汤活性成分的获取 通过TCMSP数据库检索得到桃红四物汤中成分共730个，其中白芍85个、川芎189个、当归125个、红花189个、熟地黄76个、桃仁66个。以OB≥30，DL≥0.18为ADME属性值对药物成分进行筛选，共筛选出69个活性成分，其中13个来自白芍、7个来自川芎、2个来自当归、22个来自红花、2个来自熟地黄、23个来自桃仁，见表1。检索药物靶点基因得到440个，白芍86个、川芎24个、当归44个、红花208个、熟地黄32个、桃仁46个，合并并删除重复值得到桃红四物汤药物靶点基因220个。

表1 桃红四物汤中部分活性化合物成分

2.2药物-成分-靶点网络的构建和分析 运用Cytoscape 3.7.2软件构建桃红四物汤药物-成分-靶点网络图，见图1。该网络包含266个节点(node)，480条边(edge)，倒三角形代表药物，六边形代表化合物成分，菱形代表靶点基因。利用“Network analyze”功能对网络进行拓扑属性分析，根据度值(Degree)大小设置节点的大小及颜色，颜色越深、面积越大表示该节点越重要。在药物-成分-靶点网络中，度值排名前5位的化合物分别为：kaempferol(山柰酚)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、baicalein(黄芩素)、stigmasterol(豆甾醇)、beta-carotene(β-胡萝卜素)。

图1 桃红四物汤“药物-成分-靶点”网络

2.3桃红四物汤治疗OA的潜在治疗靶点 通过GeneCards数据库和TTD数据库检索OA疾病靶点，合并及删除重复值后共得到疾病靶点1353个，通过Venny在线平台将药物靶点和疾病靶点相映射，共得到交集靶点112个，见图2。

图2 桃红四物汤治疗OA潜在靶点Venny图

2.4PPI网络的构建和分析 将获得的112个交集靶点上传至STRING 11.0平台，最低互相作用阈值设置为“high confidence”(>0.700),隐藏5个未参与的节点，将保存的TSV文件导入Cytoscape 3.7.2软件中进行拓扑属性分析，共获得107个节点(node)、1061条边(edge),平均度值19.3，按照度值进行排布，度值>20的节点有43个。度值越大证明该节点在网络中的位置越关键，作用可能越重要。得到桃红四物汤治疗OA的潜在靶点蛋白相互作用网络(PPI)，见图3，度值越大，在网络图中越明亮，图形面积也越大。根据度值筛选排名前11的靶点(Degree>40)用柱状图表示，见图4(X轴表示靶点名称，Y轴表示度值)。

图3 桃红四物汤治疗OA潜在靶点PPI网络

图4 PPI网络中排名前11的关键靶点

2.5GO富集分析和KEGG信号通路富集分析 将112个潜在治疗靶点导入到DAVID数据库，共得到GO富集条目592条(P<0.05)，包括50种细胞组分(cellular component，CC)、82类分子功能(molecular function，MF)、460个生物过程(biological process，BP)。GO富集分析柱状图见图5(蓝色表示BP、黄色表示MF、绿色表示CC)。BP方面主要富集在细胞分化、炎症反应、代谢过程、信号通路、细胞凋亡、信号调节等；MF主要富集在蛋白结合、离子结合、催化活性、酶活性调节、分子功能调节等；CC主要富集在细胞膜、细胞器、核、质膜、细胞外区域等。将富集排名前20条目用气泡图表现，见图6(横轴表示所占比例，纵轴表示GO分析条目，面积越大表示该条目基因越多)。

图5 GO富集分析二级分类

图6 GO富集分析结果

KEGG信号通路富集分析共得到106条通路(P<0.05)，涉及PI3K/Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、破骨细胞分化、p53信号通路、Wnt信号通路等。选取富集排名前20的信号通路用气泡图表示，见图7(横轴表示比例，纵轴为信号通路，面积越大表示该通路基因数目越多)。根据文献检索[15-18]发现与骨关节炎相关的信号通路有：PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、JAK/STAT3信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路等。选取关键通路，利用Cytosape 3.7.2软件构建“靶点-通路”网络，见图8(绿色圆形表示通路，蓝色菱形表示靶点)。

图7 KEGG信号通路富集分析结果

图8 “靶点-通路”网络

3 讨论

随着人类寿命的延长及人口老龄化加剧，OA成为影响老年人生活质量的主要疾病之一，并且随着现代人活动频率和强度的不断增加，OA的发病率呈现出不断年轻化的态势[19]。当前OA的治疗目的是缓解症状、改善功能、延缓进程及矫正畸形。桃红四物汤具有调节免疫、抗感染、镇痛、扩张血管、抗炎等作用[20-21]。朱兰妃[22]等运用桃红四物汤治疗气滞血瘀型膝骨性关节炎取得了较好的疗效。宋敏[23]等报道桃红四物汤可能通过与MMP-1，TIMP-1上的酶结合位点相结合而对软骨起到保护修复作用。

通过数据库检索桃红四物汤成分及药物-成分-靶点网络拓扑属性分析发现，按照度值(Degree)进行排布，桃红四物汤中排名前5的成分为：山柰酚、β-谷甾醇、黄芩素、豆甾醇、β-胡萝卜素。山奈酚是一类广泛存在于蔬菜、水果及中药材中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种功能[24]。山奈酚可以通过抑制炎症因子的表达而起到抗炎效果[25]。曾意荣等[26]认为山奈酚可以通过调控雌激素受体活性促进成骨细胞的增殖、分化和矿化达到预防骨质疏松的目的。β-谷甾醇和豆甾醇都属于植物甾醇，具有抗癌、抗氧化、抗炎等作用，研究表明β-谷甾醇抗炎作用类似氢化可的松和羟基保泰松，且无可的松类药物的副作用，还具有类似阿司匹林(乙酰水杨酸)的退热作用,而不具有溃疡性[27-28]。研究表明，黄芩素可以通过干扰花生四烯酸的代谢通路和抑制核因子的活性以及细胞因子的分泌而发挥解热镇痛抗炎的作用[29]。有学者通过大鼠实验发现黄芩素可以通过抑制血管通透性的增加而减轻骨关节炎的继发损害[30]。

在桃红四物汤治疗OA的蛋白相互作用网络(PPI)结果分析中，共有107个靶点基因，通过拓扑分析发现桃红四物汤治疗OA的潜在关键靶点有：IL6、TNF、JUN、VEGFA、IL1B，度值分别为：56、55、53、52、41。IL6和IL1B属于白细胞介素类，可以通过激活相应通路促进炎性介质的释放，IL6在外周血中的水平与KOA的严重程度呈正相关性，不仅可以通过作用T淋巴细胞和B淋巴细胞的自分泌形式影响软骨细胞的正常增殖，还可以通过增加滑膜组织的炎症细胞刺激软骨细胞的增殖，最终加重软骨细胞的破坏，影响OA的发展[31-32]。IL1B(IL-1β)是IL-1中的一种亚型，可以通过NF-κB、MAPK信号通路调控,提高促炎性因子水平，从而增强炎症反应释放炎症介质，引发关节软骨退变、破坏及降解[33]。TNF(肿瘤坏死因子)作用与IL-1类似。VEGFA(血管内皮生长因子A)对血管内皮细胞的存活、增殖、迁移和血管通透性具有较强的作用。研究表明，VEGFA可以上调MMP-1和MMP-3使软骨基质降解加速骨关节炎的进展[34]。

桃红四物汤治疗OA的GO富集分析和KEGG信号通路富集分析可以看出，GO分析中生物过程主要集中在细胞分化、炎症反应、代谢过程、信号通路、细胞凋亡、信号调节等，在治疗过程中起到了关键作用。KEGG信号通路富集分析中，PI3K/Akt信号通路在细胞的增殖、凋亡分化等方面起着重要作用，通过调节成骨细胞的凋亡参与到以骨破坏为主要特征的骨关节炎、骨质疏松等相关疾病中[35]。李晓燕等[36]在骨关节炎大鼠中发现，PI3K/AKT信号通路受抑制情况下会导致软骨细胞的凋亡和自噬，加速骨关节炎的进展。MAPK信号通路通过3级激酶级联的方式进行信号传导，与软骨细胞的增殖、分化、凋亡和炎性反应密切相关，是OA发生发展中极为重要的通路，其中MAPKs家族通路中p38MAPK、JNK及ERK1/2与OA关系最为密切[37]。Ma[38]等发现，p38MAPK信号通路在骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨、成软骨分化过程中起到良性促进作用。JAK/STAT3信号通路的激活可导致软骨细胞的破坏、促进软骨下骨硬化、滑膜细胞增殖和滑膜炎等加重OA的发生发展[39]。Hayashi等[40]发现在细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21(Cyclin dependent kinase inhibitor P21,P21)基因缺失的转基因小鼠中软骨蛋白多糖丢失加重，p-STAT3和基质金属蛋白酶-13阳性细胞的百分比更高，说明JAK/STAT3信号通路可能参与了生物因子缺乏(如P21缺乏)介导的软骨损伤的过程。

综上所述，本研究通过网络药理学方法分析桃红四物汤治疗OA的药理学机制，桃红四物汤中山柰酚、β-谷甾醇、黄芩素等成分通过PI3K/Akt信号通路、MAPK信号通路、JAK/STAT3信号通路等调控细胞增殖、分化、凋亡和炎症反应等发挥治疗作用，为桃红四物汤治疗OA提供了理论支持。网络药理学作为研究中医中药的一种新方法，但是目前仍存在缺乏相关实验验证和临床验证，因此其具体治疗机制还有待进一步研究。