子痫前期动物模型的特点及其局限性

尹祾轩，司延如，曹占鑫，柳新禄，杨潍潍

(潍坊医学院生命科学与技术学院，山东 潍坊 261053)

子痫前期(preeclampsia，PE)是孕产妇和围生儿发病和死亡的主要原因，影响着全世界5%～8%的孕产妇[1]。PE不仅影响后代健康状况，还会导致孕妇生产风险增加，包括高血压、蛋白尿、糖尿病和新陈代谢紊乱[2]。关于PE的病因和发病机制尚未阐明[3]。目前认为，PE的发病与内皮功能障碍，免疫适应性不平衡，过度炎症，氧化应激反应增加，血管生成不足和系统性血管收缩异常密切相关[4-5]。但现阶段的医学治疗并不能满足PE患者的需求，因此PE动物模型对于确定病因、开发新的治疗方法以及评估干预措施的安全性和有效性至关重要。

一个理想的PE动物模型应该表现出PE患者的症状，包括高血压、蛋白尿、宫内生长受限、内皮功能障碍和血管生成/抗血管生成因子失衡，这些症状是由妊娠早期胎盘滋养层细胞浸润不足导致，并在胎盘分娩后消失。目前，绝大多数PE动物模型是在大鼠和小鼠上进行，这些啮齿类动物与人类的胎盘类型相同，它们的胎盘表现出间质和血管内滋养层细胞的侵袭以及母体动脉的重塑。现就PE动物模型的特点及其局限性予以综述，以强调针对科学问题采用适当的动物模型的重要性。

1 血管内皮功能障碍模型

血管内皮功能障碍是PE的典型特征，其中可溶性fms样酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)以及内毒素引起的炎症反应在PE疾病中的作用得到广泛关注。

1.1sFlt-1模型 近年来，各种PE模型在疾病病理生理机制探究中被应用[6]，这使得研究人员能够更好地了解PE的病理生理机制，其中在大鼠和小鼠中过表达sFlt-1是PE的重要模型。Maynard等[7]研究证明，给予大鼠尾静脉输入外源性sFlt-1，大鼠可产生PE表型，包括高血压并伴有蛋白尿、肾小球内皮增生，且PE妊娠大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盘生长因子(placental growth factor，PIGF)的拮抗剂sFlt-1上调。sFlt-1是VEGF受体fms样酪氨酸激酶1的剪接变体，是VEGF和PIGF有效的拮抗剂，它缺乏跨膜和胞质结构域，由胎盘等许多组织产生，但其生理作用尚不清楚[8]。PE胎盘中sFlt-1信使RNA(messenger RNA，mRNA)上调，这与循环中sFlt-1蛋白的增加有关，且其含量在分娩后48 h内下降[9]。但值得注意的是，sFlt-1的全身性作用不需要存在胎盘，这表明sFlt-1对母体内皮细胞具有直接作用。此外，也有研究提出可以通过胎盘特异性基因操作，如Kumasawa等[10]采用将表达人源性sFlt-1的慢病毒载体转导至小鼠囊胚，再移植到假孕母鼠体内，通过在小鼠胎盘中特异性表达人源性fms样酪氨酸激酶1，开发了PE独特的动物模型。该模型可以观察到明显的胎盘血管生成受损和子宫内生长受限。

然而，在某些PE患者体内的sFlt-1表达并不增加，特别是迟发性PE患者。因此，在选择PE动物模型时需要根据研究目的来选择合适的动物模型。

1.2NOS抑制模型 PE发病与内皮型NOS表达减少导致的一氧化氮(nitric oxide，NO)失活之间存在很强的相关性，NO由血管内皮细胞产生，既可舒张体内血管平滑肌，又可以有效增加血管有效弹性[11]，在血压调节中起重要作用。因此，NO缺乏可导致平均动脉压升高以及血管升压素的反应敏感性增加[12]。N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)是NOS的非特异性抑制剂，有证据表明L-NAME可以作为大鼠PE综合征的诱发剂[13]。

Lu等[14]从小鼠妊娠的第13天开始，经饮水给小鼠喂养60 mg/(kg·d)的L-NAME，持续给药作用至妊娠的第20天，成功构建小鼠PE NOS抑制模型，该模型小鼠出现动脉压升高，妊娠结束时存活的胎鼠数量减少以及胰岛素抵抗明显增加。同样L-NAME在大鼠PE模型中使用也较为广泛，Yallampalli和Garfield[15]对妊娠早期大鼠皮下注射L-NAME，对照大鼠注射相同剂量的硝酸甘油，结果表明，与对照大鼠相比，每天注射25 mg/(kg·d)和50 mg/(kg·d)的L-NAME大鼠收缩压呈剂量依赖性增加，同时妊娠大鼠出现高血压、胎鼠发育迟缓等表现，符合PE的临床症状。此外，胎鼠出现了明显的体重下降，其机制尚未清楚，可能与NO调节子宫胎盘血流量有关[16]。由此可见，对孕鼠注射L-NAME可诱导产生高血压、蛋白尿、肾功能损伤、胎盘病理、肝功能损伤以及胎鼠发育受限、畸形、自然流产、死胎等，与人类PE表型极为相似[17]。虽然通过长期抑制NOS诱发的PE动物模型有很多可观的临床表现，但由于NO高度不稳定，需通过测定NO的代谢产物硝酸盐或亚硝酸盐来判断NO活性[18]，以评估临床表征的准确性。

1.3低剂量内毒素动物模型 在Faas等[19]的研究中，基于内毒素和PE引起的Shwartzman反应有许多相似的病理生理现象，所以他们提出使用内毒素诱导的妊娠大鼠构建PE动物模型。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性细菌细胞壁的一种有毒成分，其与PE胎儿生长受限密切相关。1994年，Faas等[19]在大鼠妊娠第14天经颈静脉插管1 h内滴注LPS，剂量为1.0 μg/kg，其可导致妊娠大鼠胎盘炎症，继而出现胎儿流产和胎儿生长受限症状，构建了经典的PE大鼠模型。Hu等[20]在SD大鼠妊娠第13天开始腹腔注射LPS，剂量为20 μg/kg，随后在第14～18天剂量每天增加10 μg/kg，他们认为该剂量是LPS诱导大鼠PE模型的最佳剂量，并通过酶联免疫吸附测定发现，孕鼠血清肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6等炎症因子水平升高，胎盘浸润增加，且出现高血压、蛋白尿等PE典型症状，同时胎鼠有明显的生长受限与早产症状。虽然低剂量内毒素诱导的PE模型构建操作简单、经济，但肾病理改变的报道较少。

2 子宫胎盘灌注减少模型

目前，已有多个模型动物阐明缺氧和缺氧再灌注损伤在PE病理生理中的作用[21]。子宫胎盘灌注减少(reduced uteroplacental perfusion，RUPP)在PE发病中起重要作用，因此，建立一种动物模型来模拟PE发病中子宫动脉的灌注压力和血流量减少非常有必要。Crews等[22]选取妊娠中期(妊娠第14天)的SD大鼠，将银夹(直径为0.203 mm)分别放置在大鼠腹主动脉与左、右侧卵巢动脉以减少流向子宫胎盘的血液。这种方法可使妊娠大鼠子宫灌注压降低约40%，同时可引起大鼠高血压、血管功能障碍、胎盘缺氧，约50%的胎儿丢失且存活胎儿体重减轻；此外体内循环中肿瘤坏死因子-α和sFlt-1水平升高，且VEGF和PIGF水平下降，符合PE的诊断标准。Fushima等[23]在美国癌症研究所品系中成对繁殖小鼠1～2个月，并在第14.5天时采用异氟烷麻醉妊娠小鼠，结扎卵巢分支血管束和子宫血管束构建RUPP小鼠模型。结果显示，小鼠血清中的sFlt-1水平升高，出现妊娠期高血压，蛋白尿排泄增多，胎鼠吸收和生长受限。

RUPP模型是迄今为止可重复性最高的PE啮齿动物模型[24]。但是在RUPP模型中，肾小球内皮细胞并不出现功能障碍，因此并不能用于对PE肾功能损害的研究。尽管动物RUPP模型体现了许多PE的典型临床特征，但仍存在一定的局限性，其中最重要的为RUPP模型不能用于研究PE的早期机制，尤其是PE相关的滋养层细胞侵袭，血管重塑以及这些因素引起的免疫反应；此外，为RUPP模型结扎在一定程度上造成流向心脏、胃、肾脏、肠道等器官的血流量减少，影响了心排血量和血流动力学[25]。

3 肾素-血管紧张素系统紊乱模型

在正常妊娠过程中，肾素-血管紧张素系统在蜕膜、胎盘形成和螺旋动脉重构中起重要作用。通过将表达人类血管紧张素雌性小鼠与表达人类肾素雄性小鼠交配可成功建立PE模型。胎盘中人源血管紧张素、人源肾素被分泌到母体循环，这会导致妊娠小鼠在妊娠晚期出现血压暂时升高、蛋白尿、胎盘坏死、胎鼠体重降低[26]。肾素-血管紧张素系统与血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibodies，AT1-AAs)密切相关，AT1-AAs已被证明能够特异性地刺激血管紧张素Ⅱ1型受体(一种公认的高血压介质)。血管紧张素受体与血管紧张素Ⅱ结合导致全身微动脉收缩，动脉血压升高[27]。AT1-AAs在PE患者的血清中上调，且能够激活与sFlt-1、内皮素-1上调相关的细胞内级联反应[28]。Siddiqui等[29]提取PE妊娠妇女800 μg总IgG或AT1-AAs，在小鼠妊娠第13天时经框内注射，结果显示小鼠也出现肾小球、胎盘的异常表现。虽然此类造模操作较为复杂，但该类模型可为PE与自身免疫性疾病的研究提供有效的实验工具。

4 基因操控动物模型

PE基因缺陷模型多采用基因打靶技术敲除单个基因，观察该基因缺陷动物孕期是否会出现PE样临床症状。该造模方法是以基因操控的方式，调节特定的蛋白表达，从而观察某一特点基因在PE形成中的作用。

4.1儿茶酚-O-甲基转移酶(catechol-O-methyl transferase，COMT)模型 PE患者胎盘缺氧会破坏血管生成的平衡，涉及VEGF、PLGF和sFlt-1异常表达，最终导致PE样临床症状。但是，典型的PE症状不仅仅是高表达sFlt-1和低表达PLGF，低水平sFlt-1和高水平PLGF在患者中也可存在。

Parchem等[30]的研究表明，COMT缺陷(Comt-/-)小鼠在妊娠期间表现出PE样表型。缺乏COMT的妊娠小鼠由于缺乏2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)而表现出高血压、蛋白尿、肾小球病变等PE表型。同时，Kanasaki等[31]在Comt-/-PE模型中还发现孕鼠出现宫内发育迟缓症状，且该模型中孕鼠子宫蜕膜中动脉出现了血栓的情况，而胎盘中迷路层与海绵层中的滋养层细胞和巨滋养层细胞未见异常．也未见滋养层细胞浸润情况。2-ME由COMT在胎盘中产生，它是雌二醇的天然代谢产物，在怀孕期间水平会升高，重度PE患者胎盘COMT活性受到抑制。2-ME可以改善Comt-/-妊娠小鼠的PE特征，无毒且可抑制胎盘缺氧，抑制缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和sFlt-1的表达。该模型具有许多PE样临床症状，为研究者探究PE发病与先天遗传或内分泌代谢异常间的关系提供了一定的研究方向。

4.2胎盘腺苷脱氨酶缺乏模型 胎盘在妊娠中起着多种作用，不仅支持胎儿在子宫中的生长，还可以向胎儿输送氧气、营养物质并清除母体内胎儿排泄的废物[32]，是一种在妊娠期间将母体和胎儿连接起来新形成的器官。此外，胎盘还是一种可以合成、分泌各种激素、神经递质以及血管活性分子的内分泌器官。腺苷是体内的关键信号分子，是机体缺氧时局部产生的调节性物质。但是，某些疾病状态与腺苷的长期增加相关，因此产生持久性腺苷信号是有害的[33]。以往有文献报道，孕妇的腺苷水平升高[34]。为了探究过量胎盘腺苷的病理后果，Iriyama等[35]设计了两种独立的PE动物模型，一种是仅在胎盘中腺苷水平升高的基因工程妊娠小鼠，另一种是病源性自身抗体诱导的PE动物模型。他们在实验中将雄性Ada-/-/fLi-Tg+与雌性Ada+ /-/fLi-Tg+交配，构建了仅在胎盘中腺苷水平升高的基因工程妊娠小鼠——胎盘腺苷脱氨酶缺乏小鼠，结果显示，与胎盘腺苷脱氨酶阳性小鼠相比，在胚胎的第12.5天，胎盘腺苷脱氨酶缺乏小鼠胎盘中的腺苷水平显著升高，且在第18.5天继续升高；同时，腺苷脱氨酶缺乏小鼠平均收缩压于胚胎的第15.5天开始升高，一直持续至产后第5天；尿蛋白于胚胎的第18.5天升高，一直持续至产后第7天。除上述表现外，该模型小鼠也出现了sFlt-1基因水平升高、母体出现肾脏病理改变以及胎盘重量显著降低与胎儿生长受限等PE典型症状。

该类型模型的建立为进一步探究腺苷及其相关因素在PE发病、发展中的作用提供新的研究方向。

5 小 结

随着科研人员对PE发生和发展机制认识的提高，至今人们才完全认识这种疾病的异质性，对PE疾病的新认识表明PE的特征可能是由于不同原因引起，由此科研人员尝试构建各种类型的PE动物模型，这些动物模型为PE的探究和某些致病因素提供了许多理论支持。应当指出的是，许多干预措施可以导致动物引起妊娠期高血压、蛋白尿等PE样临床症状。虽然PE的动物模型多种多样，但也各有其优缺点，且它们的重复性和特性也不相同。同时，PE动物模型由于其发病机制不同而存在自身的局限性，PE是多种因素共同作用产生的缓慢而复杂的过程，动物的胎盘形态、生理特性与人类本质上不同，所以无论哪一种模型均很难完全再现人类的病理过程。因此，研究人员必须了解每种动物模型的特点及局限性，以确保在探究疾病的同时能够选择最佳模型来解决适当的科学研究问题。在目前的情况下，根据研究的需要，可以在必要时采取多种建模方法以期更接近人类PE动物模型，从而为探索PE的发病机制以及预防和治疗提供新思路。