生地⁃黄连药对对LPS诱导大鼠抑郁样行为的影响

张 优，赵 权，李 瑶，孙 红，陈 影，井 汶，居文政

（南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao 或云连Copti teetaWall.的干燥根茎，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，其主要成分生物碱类具有降糖调脂、抗心律失常、抗菌、抗炎和抗肿瘤等作用［1］。生地为玄参科多年生草本植物地黄Rehmannia glutinosaLibosch.的块根，具有清热凉血，益阴生津之功效，现代研究发现生地化学成分环烯醚萜及其苷类具有调节血糖、抗胃溃疡、抗肿瘤、抗衰老、提高免疫力等作用［2］。有很多经典方中都含有黄连和生地这两味药，如清胃散、朱砂安神丸、黄连丸等。并且已有研究报道单味药黄连及其组分和复方以及含生地的复方有抗抑郁的作用，而黄连发挥抗抑郁作用主要有效成分盐酸小檗碱生物利用度较低，同时在实验前期，我们研究发现大剂量的生地的加入能增加黄连中盐酸小檗碱的溶出率，这与有关文献所述一致［3］。故本实验通过建立大鼠抑郁模型，探讨生地对黄连改善LPS 诱导的大鼠抑郁样行为的影响及可能的相关机制研究。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 黄连（贵州同德药业有限公司，批号20190701⁃01），生地（安徽协和成药业饮片有限公司，批号19071817），均由江苏省中医院药学部副主任中药师张倩鉴定为正品。艾司西酞普兰（大连美仑生物技术有限公司，批 号 S0610A）；LPS（美国 sigma公司，批号019M4009V）；TNF⁃α（批号 20200221）、IL⁃1β（批号20200216）、IL⁃6 ELISA（批号20200216）试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0010）；髓样分化因子88（MyD88）（批号4283）、核转录因子⁃κB（NF⁃κB）（批号8242）、磷酸化核转录因子⁃κB（p⁃NF⁃κB）（批号3036）抗体（美国CST 公司）；Toll 样受体4（TLR4）抗体（批号AF7017）、山羊抗兔二抗（批号S0001）、山羊抗鼠二抗（批号S0002）、甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号AF7021）、ECL 型超敏发光液（批号KF001）（美国Affinity 公司）。

1.2 动物 54 只SPF 级SD 雄性大鼠，体质量160～180 g，购自南通大学动物实验中心，动物生产许可证号SCXK（苏）2019⁃0001。

1.3 药物制备 分别精密称定黄连、生地药材各170 g，混合后第1 次用10 倍量的70%乙醇回流提取45 min，第2次用8 倍量的70%乙醇回流提取30 min，提取液用4 层纱布过滤，合并两次提取液，减压浓缩至170 mL，即得黄连生地合提取液（1 ∶1）（1 mL 提取液含生药量2 g）。黄连提取液以及黄连生地合提取液（1 ∶8）的制备方法同上（1 mL 提取液含生药量2 g）。各药物组的黄连量相同，均为170 g。

1.4 仪器 低温离心机（美国Thermo 公司）；精密天平（日本岛津有限公司）；全波长酶标仪（美国Thermo 公司）；电泳及转膜系统（美国Bio⁃Rad 公司）；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司）；PH 值检测仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）；高通道组织匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 大鼠抑郁模型建立及给药 SD 雄性大鼠适应性饲养1 周，将54 只大鼠根据体质量和糖水偏好率分为空白组、模型组、艾司西酞普兰组6.3 mg／（kg·d）、黄连组1.67 g／（kg·d）、黄连⁃生地1 ∶1 组3.34 g／（kg·d）、黄连⁃生地1 ∶8 组15.03 g／（kg·d）［5］。模型组腹腔注射LPS 0.5 mg／（kg·2 d）［4］，空白组同样每两天腹腔注射1 次0.9%氯化钠，注射容量为5 mL／kg。造模3 周后，糖水试验结果显示造模成功，艾司西酞普兰组按5 mL／kg 腹腔注射给药，其余5 组灌胃给药，其中空白组和模型组灌胃等容量的蒸馏水，灌胃容量均为10 mL／kg，连续灌胃2 周，给药期间仍需进行造模给药。

1.5.2 糖水偏好实验 在进行第1 次糖水实验之前，先对所有大鼠进行糖水适应，第1 天上午9 点，在每个笼子上放置2 瓶2%蔗糖水；第2 天同样时间，更换为1 瓶含2%蔗糖水和1 瓶纯水；第3 天同样时间撤掉所有水瓶，禁水禁食24 h；第4 天9 点开始正式进行糖水偏好实验，给予每只大鼠1 瓶2%蔗糖水和1 瓶纯水，测3 h 的糖水偏好，中间1.5 h 时两水瓶换一下位置。此后糖水偏好实验不需进行糖水适应，但仍需禁水禁食24 h，糖水偏好率＝（糖水消耗量／总液体消耗量）×100%。

1.5.3 强迫游泳实验 将大鼠放入高50 cm、直径20 cm的游泳玻璃容器中，水温为常温，水的高度25 cm 左右，保证大鼠爪不触及容器底面并且不会跳出容器外。游泳时间为5 min，后4 min 记录大鼠不动时间，以大鼠漂浮在水面无挣扎为不动标准。

1.5.4 敞箱实验 进行敞箱实验时，每只大鼠在同一位置放入50 cm×50 cm×50 cm 实验箱，同时对大鼠活动进行摄像，记录5 min 内大鼠的水平、垂直活动和修饰次数，每只大鼠测试完之后清理干净排泄物并用75%酒精擦拭，以穿越格数（3 爪以上立在1 格）计水平得分，以直立数（大鼠两前肢离地）计垂直得分，以理毛或洗脸数计修饰得分，计分标准均为1 次1 分。

1.5.5 ELISA 检测 取大鼠前额皮质和血清，参照ELISA试剂盒说明书检测TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃6。

1.5.6 Western blot 检测 称取大鼠前额皮质适量，加入10 倍体积的匀浆介质提取蛋白，8 000 r ／min 离心20 min，并按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书测定组织匀浆上清液中蛋白浓度为0.5 μg／μL。配置10% 分离胶，先80 V电泳20 min，再用120 V 电泳1 h。200 mA 恒流转膜70 min。封闭液封闭1 h，分别摇床孵育一抗（TLR4、MyD88、NF⁃κB 及p⁃NF⁃κB 稀释比均为（1 ∶1 000）及GAPDH（1 ∶3 000），4 ℃过夜。TBST 冲洗3 次，10 min／次，孵育二抗（稀释比1 ∶5 000）1 h，TBST 冲洗3 次，10 min／次，ECL发光并进行相应的图像采集处理。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，数据均用（）表示，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对糖水偏好率的影响 与正常组比较，模型组糖水偏好率降低（P＜0.01）；与模型组比较，艾司西酞普兰组、黄连组以及黄连⁃生地1 ∶8 组糖水偏好率升高（P＜0.05，P＜0.01），以艾司西酞普兰组最为显著（P＜0.01），黄连⁃生地1 ∶1 组无变化（P＞0.05）。见表1。

2.2 对强迫游泳不动时间的影响 与正常组比较，模型组游泳不动时间增加（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组游泳不动时间均减少（P＜0.05，P＜0.01），艾司西酞普兰组和黄连⁃生地1 ∶8 组差异无统计学意义。见表1。

2.3 对敞箱得分的影响 与正常组比较，模型组在敞箱实验中总分降低（P＜0.01）；与模型组比较，艾司西酞普兰组、黄连组及其与生地配伍组均可提高敞箱实验总分（P＜0.01），其中黄连组和黄连⁃生地1 ∶1 组作用相当。见表1。

表1 生地对黄连抗LPS 抑郁大鼠行为学的影响（， n＝9）

表1 生地对黄连抗LPS 抑郁大鼠行为学的影响（， n＝9）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 对血清和前额皮质中TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃6 的影响与正常组比较，模型组血清和前额皮质中TNF⁃α、IL⁃1β 和IL⁃6 的水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄连组、黄连⁃生地1 ∶8 组以及艾司西酞普兰组能够抑制血清和前额皮质 中TNF⁃α、IL⁃1β 和IL⁃6 的分泌（P＜0.05，P＜0.01）；黄连⁃生地1 ∶1 组血清和前额皮质中IL⁃6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），血清中TNF⁃α 水平下降（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清和前额皮质中TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃6 水平（， n＝9）

表2 各组大鼠血清和前额皮质中TNF⁃α、IL⁃1β 及IL⁃6 水平（， n＝9）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.5 对前额皮质中TLR4、MyD88、NF⁃κB 及p⁃NF⁃κB 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组前额皮质中TLR4、MyD88、NF⁃κB 的磷酸化水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，黄连⁃生地1 ∶1 组可降低前额皮质中TLR4 及NF⁃κB 的磷酸化的蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）；黄连组、黄连⁃生地1 ∶8 组以及艾司西酞普兰组能够下调前额皮质中TLR4 和MyD88 的蛋白表达及NF⁃κB 的磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01），其中以艾司西酞普兰组和黄连组最为显著。见表3、图1。

图1 LPS 大鼠前额皮质中TLR4、MyD88、NF⁃κB 及p⁃NF⁃κB 蛋白表达电泳

表3 各组大鼠前额皮质中TLR4、MyD88、NF⁃κB 及p⁃NF⁃κB 蛋白表达（， n＝3）

表3 各组大鼠前额皮质中TLR4、MyD88、NF⁃κB 及p⁃NF⁃κB 蛋白表达（， n＝3）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 讨论

目前，关于抑郁症的神经和分子机制主要有单胺递质假说、炎症免疫假说、氧化应激假说以及神经营养因子假说［6］。基于炎症免疫假说，通过注射LPS 诱导抑郁炎症模型已有很多相关报道［4，7⁃8］。同时有文献［5］基于黄连和生地能抑制细胞的凋亡和炎症因子的表达来研究黄连和生地不同配伍比例时黄连丸对链脲佐菌素糖尿病的影响，其中黄连⁃生地1 ∶8 为综合药理作用最好的配伍比例。而LPS诱导抑郁炎症模型和通过注射链脲佐菌素致糖尿病在炎症因子上有一定共性，故本实验通过黄连、经典方黄连丸中黄连和生地配伍比例1 ∶1 以及文献报道治疗糖尿病药效最强的配伍比例1 ∶8 来考察生地对黄连抗LPS 诱导的抑郁作用的影响。

糖水偏好率、敞箱得分、强迫游泳不动时间是抑郁模型常用的主要评价指标，即体现抑郁症快感缺失、运动不能及行为绝望等特点。TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 等促炎性细胞因子相较于其它炎性细胞因子与抑郁症的关系更为密切［9⁃11］。TLR4 是Toll 样天然免疫受体家族中重要成员之一，参与免疫细胞和上皮细胞等的宿主防御功能的表达［12］。NF⁃κB 是介导炎症反应及其相关的炎症因子释放的核心因子，由P50 和P65 两个亚基组成二聚体并与其抑制蛋白（Iκ⁃B）以无活性状态存在于胞液当中，当受到外界因素刺激时，Iκ⁃B 发生磷酸化，促使NF⁃κB 二聚体解离，NF⁃κB p65 入核并激活炎症相关基因的表达，促进炎症因子的释放［13⁃14］。My D88 既是TLR4 的一个重要的下游转接蛋白，同时也是NF⁃κB 信号通路中的一个关键性蛋白［15］。故本实验通过对大鼠腹腔注射LPS 建立大鼠炎症抑郁模型，TLR4 识别出LPS 发生活化并经My D88 依赖性信号转导途径促使NF⁃κB p65 入核并磷酸化，进而诱导TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 等促炎性因子的表达和大鼠抑郁样行为来研究黄连及其与生地配伍的抗抑郁作用。

本实验结果表明，与正常组比较，模型组大鼠糖水偏好率和敞箱实验总分下降，游泳不动时间延长，这提示LPS 诱导作为经典抑郁模型成功建立。各给药组可以改善LPS 诱导的大鼠抑郁样行为，抑制大鼠血清和前额皮质中TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6 的分泌 并下调 前额皮质中TLR4、MyD88、NF⁃κB 的磷酸化水平，其中黄连组抗抑郁综合疗效最显著，黄连和生地配比1 ∶8 次之。这与文献报道的相比单味黄连，黄连和生地配比1 ∶8 为治疗糖尿病效果最优结果不完全一致，考虑可能是由于两实验造模给药以及造模模型不相同所致。所以黄连可以发挥抗抑郁作用，这可能与TLR4／MyD88／NF⁃κB 介导的抗抑郁的作用机制有关，但生地的加入对于单味黄连抗抑郁作用无协同增效作用。