植物乳杆菌与反刍动物专用复合酶混合处理对玉米秸秆瘤胃降解的影响

张盛明,于兴华,刘雨龙,金天浩,梅铁瀚,马凉非,刘纹芳

(1.东北农业大学工程学院,黑龙江 哈尔滨 150030;2.东北农业大学农业工程博士后科研流动站,黑龙江 哈尔滨 150030;3.东北农业大学动物科学技术学院,黑龙江 哈尔滨 150030)

玉米秸秆含有纤维素、半纤维素和蛋白质等饲草动物可以消化利用的营养成分。新鲜的玉米秸秆可以直接饲喂食草动物或通过青贮处理等方法来提高利用率[1-2]。然而,风干玉米秸秆的质地粗糙,适口性差,不适宜直接饲喂食草动物,而且难以满足青贮饲料的原料要求。植物乳杆菌是一类可以产生乳酸的厌氧或兼性厌氧乳酸菌,乳酸可以软化秸秆木质纤维,赋予物料酸香气味,并抑制病原菌生长[3]。目前,不同的植物乳杆菌已经广泛用于制备青贮秸秆饲料[3-4]。但是,单独依靠植物乳杆菌的产酸作用,不足以克服秸秆木质纤维结构的顽抗特性。为了进一步提高秸秆的饲用品质,植物乳杆菌可以与酵母菌、枯草芽胞杆菌等菌株混合使用[5-6]。但是,多菌株发酵对过程控制要求较高,需要严格筛选菌株,而且需要避免瘤胃微生物菌群紊乱[7]。饲用酶制剂具有高催化活性和强专一性,可以降低纤维素的聚合度,破坏木质纤维聚集态结构,从而提高木质纤维原料的易降解程度[8-9]。但是酶制剂所需反应条件温和,处理过程容易滋生杂菌,所以对原料、处理过程及产品贮存环境的要求较高。

本研究以风干玉米秸秆为原料,利用植物乳杆菌和市售反刍动物专用复合酶制剂(复合酶)对风干玉米秸秆进行混合处理,研究处理条件和方法,再综合利用化学分析法、X-射线衍射仪(XRD)和扫描电子显微镜(SEM)分析处理前与处理后玉米秸秆的物理和化学结构变化,利用瘤胃降解试验评价玉米秸秆的消化率,揭示玉米秸秆理化结构变化与瘤胃降解率的内在关联,为风干玉米秸秆的饲料化利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米秸秆于2019年10月取自黑龙江省哈尔滨市成高子镇,采用饲草揉搓机搓丝处理后,剪成0.5～1.0 cm小段,40 ℃鼓风干燥24 h,作为原料备用。原料秸秆的水分和灰分含量分别为8.0%和5.5%。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)购自广东省微生物菌种保藏中心,编号:GIM 1.191(ACCC 11095),用MRS培养基对菌种冻干粉活化及复壮,获得研究用菌液,该菌液活菌数为8×108CFU·mL-1。反刍动物专用复合酶购自北京卫诺恩生物技术有限公司,该复合酶的主要成分为:纤维素酶(2 000 U·g-1)、木聚糖酶(30 000 U·g-1)、β-甘露聚糖酶(3 000 U·g-1)、β-葡聚糖酶(5 000 U·g-1)和α-半乳糖苷酶(200 U·g-1),使用0.05 mol·L-1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.8)配制成0.01 g·mL-1的酶溶液,贮存备用。红糖购自南京甘汁园糖业有限公司。

1.2 试验设计与样品处理

1.2.1 植物乳杆菌单独处理条件的确定(1)处理时间筛选:将2 mL植物乳杆菌液、2 g红糖、148 mL蒸馏水和50 g玉米秸秆试样混合均匀,装入自封袋密封(排出袋内空气,下同),转移至电热恒温培养箱中,在32 ℃条件下分别培养24、72、120、168和240 h,对照组为原料秸秆试样;处理结束后,将试样转移至鼓风干燥箱,40 ℃干燥24 h,用于后续试验与检测。(2)植物乳杆菌添加量筛选:植物乳杆菌液的添加量分别为1、4和6 mL(补蒸馏水至150 mL),处理时间为168 h,其他条件与(1)相同;(3)红糖添加量筛选:红糖添加量为0、1和4 g,处理时间为168 h,其他条件与(1)相同。

1.2.2 复合酶单独处理时间的确定根据复合酶使用说明中精料补充料的添加量0.04%进行适当调整,将添加量定为0.4%。将20 mL酶溶液、130 mL蒸馏水与50 g秸秆试样混匀,装入自封袋密封。32 ℃分别处理24、36和48 h,然后将试样转移至鼓风干燥箱,40 ℃干燥24 h后,用于后续试验与检测。

1.2.3 植物乳杆菌单独处理、复合酶单独处理与混合处理的比较试验组1:将2 mL植物乳杆菌液、2 g红糖、148 mL蒸馏水与50 g秸秆试样混合均匀,装入自封袋密封,32 ℃处理168 h;试验组2:将20 mL酶溶液、130 mL蒸馏水与50 g秸秆试样混合均匀,装入自封袋密封,32 ℃处理36 h;试验组3:将2 mL植物乳杆菌液、2 g红糖、128 mL蒸馏水、20 mL酶溶液与50 g秸秆混合均匀,装入自封袋密封,32 ℃处理168 h;对照组:加未处理秸秆试样。试验结束后,将试样转移至鼓风干燥箱,40 ℃干燥24 h,用于后续试验与检测。上述每组处理均重复3次。

1.3 玉米秸秆的物理结构和化学成分分析

1.3.1 化学成分分析根据文献[10]的方法测定处理前、后玉米秸秆试样的化学成分:利用硝酸-乙醇法测定纤维素含量;利用亚氯酸钠法测定总纤维素含量;总纤维素含量减去纤维素含量,计算得到半纤维素含量;利用硫酸两步水解法测定酸不溶性木质素含量;利用紫外可见分光光度计测定酸溶性木质素含量;利用烘箱干燥法和灼烧法测定水分和灰分含量;利用苯酚-硫酸法测定总糖与还原糖含量;采用海能K1100凯氏定氮仪(济南海能仪器股份有限公司)测定粗蛋白(CP)含量。以上测试结果均用原料秸秆干物重的百分数表示。

1.3.2 纤维素相对结晶度分析使用Empyrean智能X射线衍射仪(荷兰Panalytical分析仪器公司)记录处理前、后秸秆试样的XRD谱图。测试条件:射线源Cu/Kα,管流40 mA,管压40 kV,扫描范围10°～50°,扫描速度2°·min-1。根据Segal公式[11-12]计算秸秆试样的纤维素相对结晶度(CrI):

CrI=(I002-Iam)/I002×100%,

式中:I002为21.7°附近最高峰衍射强度,即结晶区与非结晶区之和(002 面衍射强度);Iam为18.5°处附近小峰衍射强度,即非结晶区强度。

1.4 秸秆试样的形貌分析

将秸秆试样转移至鼓风干燥箱内,105 ℃干燥6 h,取出试样粘贴到样品台,喷金处理,使用FEI QUATA200扫描电子显微镜(荷兰FEI公司)观察试样的形貌变化。

1.5 玉米秸秆在瘤胃降解情况分析

根据周爽等[13]和van Soest等[14]的方法测定瘤胃降解试验前、后不同玉米秸秆试样的干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量。根据李洋等[15]的方法测定不同玉米秸秆试样在牛瘤胃的降解率。选用3头体重约650 kg、装有瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛,准确称取7 g秸秆试样装入称重后的尼龙袋投入牛瘤胃,每头牛每个时间点设置3个平行,降解时间为24和48 h,取出测定营养成分,最后根据瘤胃降解参数和Excel 2018处理的数据,计算DM、NDF和ADF的消失率。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 17.0软件的单因素方差法分析数据,利用Duncan’s多重比较法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌处理对玉米秸秆化学成分的影响

从表1可见:随着乳杆菌处理时间延长,玉米秸秆pH值下降,当处理时间达到72 h,pH值降至4.0左右,然后趋于稳定,表明植物乳杆菌进入生长稳定期;处理168 h,纤维素、半纤维素和木质素含量趋于稳定,与处理前差异显著(P<0.05),纤维素与木质素在纤维素、半纤维素和木质素总含量中的占比分别提高2.1%和2.3%,半纤维素在纤维素、半纤维素和木质素总含量中的占比降低4.7%;乳杆菌对玉米秸秆总糖含量的影响不大, 但处理72 h,还原糖含量比处理前减少69.1%(P<0.05); 除试样1-3以外,其他检测的8组试样的粗蛋白含量差异不显著(P>0.05),植物乳杆菌单独处理不能提高玉米秸秆试样的粗蛋白含量。当菌液添加量低于2 mL或红糖添加量少于2 g时,处理168 h玉米秸秆的pH值不能降低至4.0,表明植物乳杆菌不能较快进入生长稳定期、积累乳酸,处理效果未达预期;试样1-5、1-6、2-2、2-3和3-3的纤维素、半纤维素和木质素含量差异不显著(P>0.05),因此,菌液和红糖的最低添加量分别定为2 mL和2 g。

表1 植物乳杆菌处理对玉米秸秆化学成分的影响Table 1 The effect of Lactobacillus plantarum on chemical composition of corn straw

2.2 复合酶处理对玉米秸秆化学成分的影响

从表2可见:复合酶处理前、后秸秆木质素和粗蛋白含量差异不显著(P>0.05);处理24 h后,试样的纤维素、半纤维素和木质素含量趋于稳定;当处理时间为48 h,部分处理组试样出现变质现象。虽然处理36 h试样与处理24 h试样的纤维素、半纤维素和木质素含量差异均不显著(P>0.05),但处理36 h试样与未处理试样的纤维素、半纤维素含量差异显著(P<0.05),所以将复合酶单独处理时间定为36 h。

表2 复合酶处理时间对玉米秸秆化学成分的影响Table 2 The effect of treatment time of ruminant complex enzyme on chemical composition of corn straw

2.3 不同处理条件对玉米秸秆化学成分的影响

乳杆菌单独处理168 h和复合酶单独处理24～36 h,试样纤维素、半纤维素和木质素含量均趋于稳定,将混合处理时间定为168 h。从表3可见:复合酶单独处理试样与未处理试样相比,纤维素与木质素含量差异均不显著(P>0.05);混合处理试样与未处理试样相比,纤维素、半纤维素和木质素含量差异显著(P<0.05),纤维素与木质素含量分别提高7.4%和7.7%,半纤维素含量降低4.0%;与其他3组试样相比,混合处理试样的纤维素在纤维素、半纤维素和木质素中的质量占比提高量最大,半纤维素的质量占比降低量最大;复合酶单独处理与混合处理均不能提高试样的粗蛋白含量。

表3 不同处理对玉米秸秆化学成分的影响Table 3 The effect of different treatment conditions on chemical composition of corn straw

2.4 玉米秸秆营养成分的瘤胃降解情况

从表4可见:与处理Ⅰ相比,处理Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的DM 24 h消失率分别提高36.0%、6.9%和44.7%,48 h消失率分别提高9.9%、3.6%和14.2%;NDF 24 h消失率分别提高21.2%、5.9%和42.1%,48 h消失率分别提高15.0%、1.9%和16.4%;ADF 24 h消失率分别提高25.6%、15.5%和28.3%,48 h消失率分别提高10.7%、3.3%和16.7%。与其他处理相比,混合处理对玉米秸秆试样DM、NDF和ADF消失率的提高效果最为显著。

表4 不同处理玉米秸秆干物质(DM)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)的消失率Table 4 The disappearance rate of dry matter(DM),neutral detergent fiber(NDF)and aciddetergent fiber(ADF)of different treated corn straw samples

2.5 不同处理玉米秸秆的SEM分析

从图1可见:处理Ⅰ的结构致密,纤维表面光滑、平整;与处理Ⅰ相比,处理Ⅳ的纤维表面较为粗糙,表面孔洞数量增加,形成较大裂痕及间隙,在秸秆表面观察到植物乳杆菌菌体。

图1 未处理和混合处理玉米秸秆试样的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron microscopy of the untreated and mixed treated corn straw samples A. 玉米秸秆试样Ⅰ(×300)Corn straw sample Ⅰ(×300);B. 玉米秸秆试样Ⅳ(×300)Corn straw sample Ⅳ(×300);C. 玉米秸秆试样Ⅰ(×3 000)Corn straw sample Ⅰ(×3 000);D. 玉米秸秆试样Ⅳ(×3 000)Corn straw sample Ⅳ(×3 000).

图2 不同处理玉米秸秆的X-射线衍射仪(XRD)谱图Fig.2 X-ray diffraction(XRD)spectra of different treated corn straw samples

2.6 不同处理玉米秸秆的纤维素相对结晶度

从图2可见:处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在18.5°处的衍射峰强度分别为14 370、16 431、13 293和13 419,在21.7 °处的衍射峰强度分别为21 488、25 976、17 878和19 125。根据 Segal公式计算,处理Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的CrI值分别为33.13%、36.75%、25.65%和29.84%。结果表明,混合处理和复合酶单独处理均可以降低玉米秸秆试样的纤维素相对结晶度。

3 讨论

本研究表明:采用植物乳杆菌单独处理玉米秸秆0～72 h,试样的pH值显著下降,还原糖含量显著降低,表明植物乳杆菌在生长繁殖过程中利用了来源于红糖和还原糖的碳源,乳酸积累导致pH值降低。处理72 h,试样的还原糖含量降低至0.30%左右,处理120 h半纤维素含量显著下降。Garde等[16]研究发现,短乳杆菌和戊糖乳杆菌可以转化利用木糖和阿拉伯糖。Zhao等[17]研究发现,半纤维素在酸性条件下易降解为木聚糖,而植物乳杆菌可以转化利用木聚糖。因此,试样还原糖近乎消耗殆尽后,植物乳杆菌开始利用来源于半纤维素的碳源。半纤维素降解可以导致木质纤维基质产生孔洞和间隙,比表面积增大[18]。因此,试样半纤维素含量降低提高了瘤胃微生物对纤维素组分的降解效率。粗饲料NDF的瘤胃消失率越高,表明反刍动物对营养成分的消化利用率越好[19-20]。植物乳杆菌处理24和48 h试样NDF消失率分别提高21.2%和15.0%。本研究结果与刘晶晶等[21]的乳酸菌发酵有利于提高秸秆饲料的家畜消化率一致。

采用复合酶单独处理玉米秸秆,试样的纤维素、半纤维素和木质素在纤维素、半纤维素和木质素总质量中的占比变化不大,但纤维素相对结晶度降低了18.2%,处理24 h和48 h的NDF消失率分别提高5.9%和1.9%。马欢等[22]研究发现,纤维素的无定形区比结晶区更容易被生物转化或化学降解。张俊等[23]研究表明,纤维素酶可以降低纤维素的相对结晶度,从而使纤维素更容易发生降解。因此,本研究试样NDF消失率的提高可以归因于复合酶处理降低了玉米秸秆纤维素的相对结晶度。

与未处理、乳杆菌单独处理和复合酶单独处理相比,混合处理试样的NDF 48 h消失率分别提高16.4%、1.2%和14.2%,特别是NDF 24 h消失率分别提高42.1%、5.9%和21.2%,表明混合处理试样更容易被动物快速消化利用。复合酶在混合处理过程中的作用:降低试样纤维素的相对结晶度,提高瘤胃微生物对纤维素组分的降解效率;试样相对结晶度降低可以提高植物乳杆菌对秸秆木质纤维基质的处理效率。值得注意的是,混合处理试样的纤维素相对结晶度高于复合酶单独处理试样。任海伟等[24]研究发现,当玉米秸秆纤维素结晶区转变为无定形区后,秸秆更容易被生物转化为沼气。然而,姚兰等[25]研究发现,稀酸处理可以破坏纤维素的无定形区,使氢键重排,发生重结晶现象,导致纤维素相对结晶度提高,但稀酸处理试样的纤维素酶解转化率仍然有所提高。此外,一些研究发现农作物秸秆中木质素和半纤维素含量的改变会对纤维素相对结晶度的测定值产生影响[26-27]。因此,玉米秸秆木质纤维的实际降解效率由其化学组分、化学结构和纤维形态等多因素共同决定。

综上所述,玉米秸秆的混合处理条件为8×108CFU·mL-1植物乳杆菌液2 mL,红糖2 g,蒸馏水128 mL,0.01 g·mL-1复合酶溶液20 mL,秸秆50 g,混匀后密封在自封袋中,32 ℃处理168 h。混合处理后,秸秆试样在瘤胃中的DM、NDF和ADF的24和48 h消失率均显著提高,处理后秸秆试样的气味酸香,饲料化利用价值显著提高。