饲粮中添加染料木黄酮对产蛋后期种母鸡繁殖性能的影响

魏全伟,吕增鹏,胡晨辉,戴宏建,李思梦,孙涛,石放雄*

(1.南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095;2.德州市陵城区畜牧兽医服务中心,山东 德州 253500)

蛋鸡产蛋高峰期过后,产蛋性能逐步降低,这在地方品种种母鸡上表现特别明显。产蛋后期蛋鸡卵巢功能衰退、雌激素水平下降是造成产蛋性能急剧下降的主要原因[1]。因此,研究植物源雌激素对产蛋后期种母鸡繁殖性能的影响,对于提高种母鸡的利用率,延迟下架时间,提高经济效益具有重要意义。

染料木黄酮是一种异黄酮类植物提取物,广泛存在于豆科植物中,结构与雌激素类似。染料木黄酮在一定剂量范围内能够与雌激素受体结合,发挥类雌激素作用[2]。研究表明,植物雌激素能够参与机体代谢,调节体内生殖激素合成和分泌[3]。染料木黄酮具有多酚羟基的分子结构,可以消除机体内多种自由基,是抗氧化能力最强的大豆异黄酮,经常在试验中被用作抗氧化剂[4]。据此,我们推测染料木黄酮能够改善卵巢抗氧化能力和生殖功能,提高蛋鸡的繁殖性能。本试验在日粮中添加染料木黄酮,旨在阐明其对产蛋后期种母鸡繁殖性能和卵巢抗氧化能力的作用,对于开发染料木黄酮作为新型种母鸡饲料添加剂具有重要参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验动物

染料木黄酮:提取自金雀花,纯度98%(西安凯萌生物技术有限公司)。试验动物选用栖岭草鸡种母鸡,基础日粮参照中国鸡饲养标准(2004)配制成粉状全价料。基础日粮配方及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成和营养组成水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air dry basis) %

1.2 试验设计与饲养管理

动物饲养试验地点为江苏三德利牧业发展有限公司土山种鸡场,试验流程严格按照南京农业大学动物福利委员会相关规定进行。试验选用体重和生理状态相近的58周龄栖岭草鸡180只,随机分为3组:对照组(Con)、低剂量染料木黄酮组(L-Gen)、高剂量染料木黄酮组(H-Gen),每组5个重复,每重复12只鸡。采用负压通风的鸡舍常规阶梯式笼养,每笼3只鸡。对照组喂养玉米-豆粕型基础日粮。L-Gen组和H-Gen组在基础日粮中分别添加20和40 mg·kg-1染料木黄酮,添加剂量参照相关文献[5-6]设定。预饲期2周,统一饲喂对照组日粮,期间根据产蛋率进行适当调整,保证每个重复产蛋率接近。正式试验从60周龄开始,连续进行28 d,每只鸡每天给料112 g,自由饮水,采用正常人工输精。鸡舍采用光照16 h和黑暗8 h的照明程序,相对湿度(50±5)%,温度(25±3)℃。

1.3 样品采集

试验第28天,每个重复中随机选择2只鸡翅静脉采血,静脉放血处死。收集血液,4 ℃静置12 h后,低温下3 000 r·min-1离心10 min,得到血清并保存于-30 ℃用于分析。此外,采集下丘脑、卵巢组织和小黄卵泡样品迅速置于液氮,-80 ℃保存用于分析。

1.4 产蛋性能测定及蛋品质测定

每天记录每个重复的产蛋数、蛋重,计算试验期间每周产蛋率、平均蛋重。产蛋率=每周产蛋总蛋数/(种鸡数×7)×100%。试验最后1天从每个重复中随机抽取10枚种蛋,测定蛋白高度、蛋壳强度、哈氏单位、蛋黄色泽、蛋黄重、蛋壳厚度。称取蛋重后,采用蛋品质检测仪(奥卡,美国)检测蛋壳强度。将蛋壳去除壳膜后,用游标卡尺分别测量蛋壳大、中、小端的蛋壳厚度3次,然后取平均数。采用罗氏比色扇进行等级比色,确定蛋黄色泽等级。蛋黄称重后,用蛋白高度检测仪(奥卡,美国)检测蛋白高度,计算哈氏单位:哈氏单位=100 lg(蛋白高度-1.7×蛋重×0.37+7.57)。

1.5 血清中雌二醇和孕酮含量测定

采用放免法(RIA)试剂盒(上海生工生物工程有限公司)检测血清中雌二醇和孕酮的含量。血浆中的雌二醇、孕酮抗原与I125-E2、I125-P4抗体竞争结合,形成抗原抗体复合物。加入免疫分离剂,静置30 min使免疫复合物沉淀出来,4 ℃条件下3 600 r·min-1离心20 min,弃上清液,用γ计数仪测量沉淀的放射性计数。雌二醇、孕酮浓度与I125标记的抗原抗体复合物呈负相关的函数关系,并表现在剂量反应曲线上,以该曲线为依据即可对样品进行定量。

1.6 基因表达检测

取100 mg下丘脑和卵巢组织样品加入1 mL Trizol提取液(Invitrogen),按照试剂盒说明书提取总RNA。提取的总RNA用核酸分光光度计(AG 22331,Eppendorf)检测其纯度。取1 μg总RNA加入20 μL反应体系,采用M-MLV cDNA试剂盒(Invitrogen)进行反转录。将反转录产物1∶1稀释后,选用SYBR®Select Master Mix PCR Kit并按照说明书进行RT-PCR操作,反应仪器为7500荧光检测系统(Applied Biosystems,USA)。目标基因和内参基因的引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如表2所示。PCR程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环。使用熔解曲线验证单个产品的扩增。对内参基因GADPH标准化后,采用2-ΔΔCT法分析基因相对表达水平。

表2 基因的引物序列Table 2 The primer sequence of genes

1.7 卵巢抗氧化能力检测

取卵巢组织1 g,4 ℃匀浆1 min,在4 ℃条件下12 000 r·min-1离心10 min。使用BCA试剂盒测量蛋白浓度后,采用试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测总超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)。

1.8 数据处理与分析

图1 染料木黄酮对种母鸡生产性能的影响(n=5)Fig.1 Effects of genistein on the laying performance of breeder hens Control:对照组Control group;L-Gen:20 mg·kg-1染料木黄酮组20 mg·kg-1 genistein group;H-Gen:40 mg·kg-1染料木黄酮组40 mg·kg-1 genistein group. 下同The same as follows. *表示与对照组相比具有显著差异(P<0.05)。 *indicates significant difference compared with control group(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 染料木黄酮对生产性能的影响

饲粮中添加染料木黄酮对产蛋后期种母鸡产蛋率的影响如图1所示:试验第2周开始,H-Gen组种母鸡产蛋率高于对照组(P=0.074),第3、4周产蛋率显著高于对照组(P<0.05)。此外,L-Gen组平均蛋重在第3、4周时较对照组显著增加;H-Gen组在第4周平均蛋重显著高于对照组(P<0.05)。

2.2 染料木黄酮对种蛋品质的影响

如表3所示:种母鸡饲粮中添加染料木黄酮对于种蛋的蛋白高度、哈氏单位、蛋黄重均没有显著影响。L-Gen组和H-Gen组蛋壳强度和蛋黄色泽等级相比对照组显著提高(P<0.05)。此外,相比于对照组,L-Gen处理显著增加蛋壳厚度(P<0.05)。

表3 染料木黄酮对种母鸡蛋品质的影响(n=5)Table 3 Effects of genistein on egg quality of breeder hens

2.3 染料木黄酮对血清雌激素和孕酮含量的影响

如图2所示:L-Gen组血清中雌激素(P=0.079)和孕酮(P=0.098)含量与对照组相比有提高的趋势;H-Gen 组血清中雌激素和孕酮含量与对照组相比显著提高(P<0.05)。

图2 染料木黄酮对种母鸡血清中雌激素、孕酮含量的影响(n=8)Fig.2 Effects of genistein on the serum estrogen and progesterone content

2.4 染料木黄酮对卵泡中雌激素受体mRNA表达水平的影响

图3 染料木黄酮对种母鸡卵泡中雌激素受体 基因mRNA表达水平的影响Fig.3 Effects of genistein on the estrogen receptor gene(ER)mRNA expression level in the ovarian follicle

如图3所示:饲粮中添加20或40 mg·kg-1染料木黄酮均显著提高了种母鸡小黄卵泡中ERαmRNA表达水平(P<0.05);L-Gen组小黄卵泡中ERβmRNA表达水平较对照组显著上调(P<0.05)。

2.5 染料木黄酮对下丘脑GnRH和卵泡FSHR、LHR mRNA表达水平的影响

如图4所示:L-Gen组种母鸡下丘脑GnRH(促性腺激素释放激素)基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)。同时,染料木黄酮处理组小黄卵泡FSHR(卵泡刺激素受体)mRNA相对于对照组表达水平显著上调(图4,P<0.05)。染料木黄酮处理对小黄卵泡LHR(黄体生成素受体)mRNA表达水平没有影响。

图4 染料木黄酮对下丘脑中GnRH基因和卵泡中激素受体FSHR、LHR基因mRNA表达的影响Fig.4 Effects of genistein on the mRNA expression of GnRH gene in the hypothalamus,and FSHR, LHR genes in the ovarian follicle

2.6 染料木黄酮对卵巢抗氧化能力的影响

从图5中可以看出:饲粮中添加染料木黄酮显著提高种母鸡卵巢组织中SOD活性(P<0.05)。此外,L-Gen组和 H-Gen 组卵巢组织中的T-AOC含量也显著高于对照组(P<0.05)。

图5 染料木黄酮对种母鸡卵巢超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力的影响Fig.5 Effect of genistein on SOD activity and total antioxidative capability(T-AOC)of ovary

3 讨论

3.1 染料木黄酮对产蛋后期种母鸡生产性能的影响

大量研究表明,饲粮中添加大豆异黄酮能够提高家禽的生产性能[7-8]。曹满湖等[7]研究表明,在产蛋后期海兰褐蛋鸡饲粮中添加大豆异黄酮4周后,产蛋率和卵巢内卵泡数量显著提高。染料木黄酮结构与雌激素相似,在大豆异黄酮中具有最强的类雌激素功效。本研究结果表明,饲粮中添加40 mg·kg-1染料木黄酮显著提高产蛋后期栖岭草鸡的产蛋率;饲粮中添加20 mg·kg-1染料木黄酮4周后,平均蛋重显著提高。周玉传等[8]研究也表明,饲粮中添加染料木黄酮显著提高绍兴鸭产蛋率,降低料蛋比。我们推测这可能与染料木黄酮类雌激素参与到机体生殖激素调控,改善卵巢功能有关。

3.2 染料木黄酮对产蛋后期种母鸡蛋品质的影响

大量的钙在蛋鸡肠道被吸收后运送到输卵管壳腺部,从而形成蛋壳。因此,蛋壳品质与钙的吸收和利用密切相关。据报道,在饲粮中添加染料木黄酮可以提高机体对钙的吸收,提高血清中钙浓度[9],增加壳腺形成过程中钙的沉积量[10]。在鹌鹑的饲养试验中发现,饲粮中添加800 mg·kg-1的染料木黄酮显著提高蛋壳厚度、蛋壳重和哈氏单位[11]。本试验中染料木黄酮提高种鸡蛋壳强度和蛋壳厚度的结果与之相一致。此外,染料木黄酮处理组蛋黄颜色较对照组显著加深,这表明染料木黄酮已沉积在鸡蛋中,这与Saitoh等[12]的报道一致。因此,饲粮中添加染料木黄酮能够提高产蛋后期种鸡的蛋品质。

3.3 染料木黄酮对产蛋后期种母鸡血清中雌激素和孕酮含量的影响

家禽的生殖功能是受内分泌调控的复杂生理过程,下丘脑-垂体-性腺轴调控发挥着重要作用。下丘脑分泌的GnRH,垂体分泌的LH、FSH以及卵巢分泌的雌激素、孕酮共同参与生殖调控[13]。本试验结果表明,种母鸡饲粮中添加40 mg·kg-1染料木黄酮显著提高血清中雌激素、孕酮含量,这与产蛋率提高的结果相一致。雌激素和孕酮对颗粒细胞的发育具有重要的调控作用,而颗粒细胞的发育状况直接决定卵泡的生长、选择和闭锁[14]。据报道,血清中生殖激素的变化可能是由于染料木黄酮激活下丘脑-垂体-性腺轴,促进雌激素分泌,进而促进孕酮分泌引起的[15]。本试验进一步检测发现,染料木黄酮处理显著上调下丘脑GnRHmRNA的表达水平。这进一步验证了染料木黄酮通过激活丘脑-垂体-性腺轴参与机体生殖激素调控。

3.4 染料木黄酮对产蛋后期种母鸡卵泡中ER和FSHR的影响

母鸡卵巢内只有极少的卵泡能够发育成熟然后排卵,绝大多数的卵泡最终都会发生闭锁。禽类卵泡按照严格的等级体系顺序发育,每天有1个大黄卵泡成熟后排出,同时会有1个小黄卵泡被选中进入等级体系。在整个过程中,被选入进入排卵前等级体系小黄卵泡的发育极其重要。产蛋后期家禽产蛋率下降的主要原因是小黄卵泡的数量减少[16]。本研究发现,在种母鸡饲粮中分别加入20和40 mg·kg-1染料木黄酮4周后,小黄卵泡中FSHR、ERα和ERβmRNA表达水平较对照组显著提高。笔者前期研究表明,饲粮中添加染料木黄酮能够提高种母鸡血清中FSH水平[17]。FSH是促进卵泡发育的重要生殖激素,能够激活FSHR,促进卵巢血液循环,增加卵泡壁的摄氧量,促进卵黄物质的沉积和卵泡质量的增加,减少卵泡闭锁。ER则通过对卵巢直接作用和在下丘脑-垂体轴的负反馈作用2条途径调节卵泡的发育和排卵[18]。下丘脑内的GnRH作为调控垂体分泌FSH的重要激素,其表达水平的提高可能是引起FSHR和ER水平变化的主要原因。

3.5 染料木黄酮对产蛋后期种母鸡卵巢抗氧化能力的影响

随着年龄增长,雌激素水平下降,缓解卵巢氧化应激的作用降低[19]。组织内自由基聚集导致的氧化应激是卵巢功能衰退的重要诱因之一[20]。年龄相关的卵母细胞退化伴随着自由基过量,导致线粒体功能失常,对细胞造成的损伤加剧[21]。饲粮中添加抗氧化剂来减少氧化应激对机体的损伤,已经成为一种重要的营养调控手段。染料木黄酮结构中的酚羟基能够作为氢供体结合氧自由基,缓解氧化应激。研究表明,染料木黄酮处理体外培养的牛乳腺上皮细胞,可显著提高其抗氧化能力,减少丙二醛含量[22]。臧长江等[23]研究发现,在伊犁母马饲料中添加染料木黄酮可以显著提高机体的抗氧化能力。在本试验中,给种母鸡饲粮中分别添加20和40 mg·kg-1染料木黄酮显著提高卵巢组织的T-AOC含量,增强卵巢的抗氧化能力,这与卵巢雌激素等分泌功能增强相一致。前人报道,染料木黄酮能够结合在雌激素受体,激活ERK1/2和NFκB信号通路,从而上调MCF-7细胞的MnSOD基因表达[24]。在本研究饲粮中添加染料木黄酮显著提高卵巢组织SOD活性。总之,饲粮中添加染料木黄酮可能通过提高机体抗氧化能力改善产蛋后期蛋鸡卵巢功能。

综上,产蛋后期种母鸡饲粮中添加染料木黄酮能提高血清中雌激素和孕酮含量,上调下丘脑GnRH表达水平以及卵泡中FSHR和ERαmRNA表达水平,提高卵巢抗氧化能力,从而改善产蛋性能和蛋品质。40 mg·kg-1染料木黄酮添加水平对于改善种母鸡产蛋性能的效果更佳。