美洲大蠊胸腺素对小鼠毛发生长的影响研究

颜琳， 高洁， 张毅鹏， 王红梅， 陈勤， 沈咏梅， 岳碧松， 张修月*

(1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065；2. 药用美洲大蠊四川省重点实验室，好医生药业集团有限公司，成都610031； 3. 中齐建设工程有限公司，成都610094)

毛发生长是一个复杂的过程，受营养、环境、遗传和生理水平等多种因素的影响(王婷等，2013)。脱发是一种由多种因素引起的头部毛发脱落的常见疾病，脂溢性脱发、斑秃等问题一直是临床治疗的难题。目前，临床上针对脱发的药物很少，限制了对脱发等疾病的有效治疗。

胸腺素最初是从小牛胸腺提取的一种淋巴细胞生长因子，分为α、β、γ三类。有关β族胸腺素的研究最多，其中Tβ4是β族胸腺素中的主要成员，脊椎动物Tβ4有多种功能，如促血管生成和伤口愈合(Badamchianetal.，2003；Kimetal.，2011；于虎等，2011)、肿瘤转移(Chaetal.，2003；马艺欣，2017)、促细胞迁移(Freemanetal.，2011)等，且Tβ4的应用研究已进入临床阶段。此外，多个研究还发现，脊椎动物Tβ4与毛囊发育和毛发生长周期的调节有密切联系，对毛发生长有促进作用(Chaetal.，2010；李晔等，2014；高笑宇，2015)。目前关于无脊椎动物胸腺素的研究较少，但研究发现，它们与脊椎动物Tβ4有类似的功能，如激素调节(Tanaka，2012)、促伤口愈合(Hinkeletal.，2015；何文耀等，2018)、参与免疫应答(周鑫鑫，2018)等。美洲大蠊Periplanetaamericana是一种传统药用昆虫，其醇提物具有促伤口愈合与组织修复(何正春等，2007)、增强机体免疫(周琼等，2008)、抗肿瘤(王飞等，2011)等功能，但其药效成分和药理尚不清楚。本研究首次探讨了美洲大蠊胸腺素对小鼠毛发生长的影响，并对促毛发生长的作用机理进行了初步探讨，为美洲大蠊潜在药用价值开发和应用提供基础数据。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物

90只实验用C57BL/6小鼠购自四川大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2018-026，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2018-185，雄性，周龄为7～8周，体质量为15～20 g，按照屏障系统设施要求进行饲养环境管理。小鼠饲料和垫料均为SPF级，购自成都达硕生物公司。

1.2 实验试剂及耗材

美洲大蠊胸腺素THY1、THY2、THY3由本实验室原核表达纯化获得(Jingetal.，2019)。人源胸腺素Tβ4购自肽佳生物(批号：800034)。PBS、qPCR八连管、脱脂棉、手术剪、镊子、直尺和冻存管均购自成都奥克公司。脱毛膏(批号：83155367，日本Veet)。动物总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和2×Taq SYBR Green qPCR Mix购自北京聚合美生物科技有限公司。4%多聚甲醛购自成都奥创公司。

1.3 主要设备仪器

荧光定量PCR仪：Bio-Rad(型号：CFX96 Touch)；普通光学显微镜：日本Olympus(型号：CX23)；正置荧光显微镜：Leica(型号：DM4 B)。

1.4 动物模型制备及给药

将C57BL/6小鼠放于室温18～22 ℃、相对湿度30%～50%的动物房中适应性饲养1周后，随机分成5组：Tβ4组(阳性对照组)、THY1组、THY2组、THY3组和PBS组(空白对照组)，每组18只。将小鼠背部毛发用电动剃毛器剔除后，均匀涂抹脱毛膏，面积约为2 cm×2 cm。放置2 min后，轻轻用脱脂棉擦去皮肤表面的脱毛膏，并用温水清洗干净。

脱毛24 h后，将不同的药物直接涂抹于小鼠脱毛区光滑无伤痕的背部皮肤上，给药体积为50 μL，THY1组、THY2组、THY3组和Tβ4组的药物浓度均为500 μg·mL-1，每24 h给药一次，每隔48 h拍照一次。观察不同组毛发生长情况。

1.5 小鼠背部皮肤组织学观察

在实验第6天、第12天和第18天，每组随机取5只小鼠背部皮肤，部分固定在4%多聚甲醛中，部分放在冻存管中并迅速放入液氮罐。将固定后的皮肤组织送成都奥创公司制作皮肤组织的HE切片(纵切，切片厚度为 2 μm)，在100倍显微镜下观察毛囊的发育情况并统计毛囊数量。

1.6 实时荧光定量PCR

将液氮速冻后的皮肤组织放在-80 ℃中保存备用。按照动物总RNA提取试剂盒说明书和反转录试剂盒说明书提取小鼠背部皮肤总RNA，并制备相应的cDNA，-20 ℃保存备用。β-连环蛋白(β-catenin)引物(Kimetal.，2019;F：5’-CCCACTAATGTCCAGCGTTT-3’，R：5’-AACCAAGCATTTTC-ACCAGG-3’)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)引物(Chunetal.，2015；F：5’-ATCGCAGACTCCTG GAATG-3’，R：5’-CCAGCCAGTCTGATTTGATG-3’)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)引物(Jinetal.，2014；F：5’-AGAGACCCTTTGCGGGGTGA-3’，R：5’-CTTCTGAGTCTTGGGCATGT-3’)由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。以β-actin作为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算。

1.7 小鼠背部毛发生长情况评估

在实验第13～17天，每日从小鼠背部相同位置用镊子取部分毛发进行测量。每组取5只小鼠，每只随机挑选5根毛发并用直尺测量长度，记录毛长情况。

1.8 统计学数据分析

使用Graphpad prism 8.4.0进行数据分析，采用单因素方差分析，显著性水平设置为α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠背部脱毛区毛发生长情况

在造模完成后立即对小鼠背部进行拍照，此后每48 h进行拍照。各组脱毛后，皮肤均呈粉红色，毛发进入休止期。给药6 d后，给药组开始变黑；给药8 d后，给药组明显变黑而PBS组还呈粉红色；给药12 d后，给药组均长出1层细密的毛发，而对照组仅部分区域长出毛发(图1)。

2.2 小鼠背部皮肤切片观察情况

8周龄小鼠毛囊大部分处于休止期(曾明辉，谭正怀，2008)，此时的毛囊下段退化，毛乳头上移至立毛肌附着处(江乐文等，2020)。给药 6 d 后，给药组小鼠毛囊向下生长至皮下深层，进入生长期，而PBS组仍停滞在真皮层；给药12 d后，黑色素囤积，小鼠皮肤毛囊数增多，给药组毛囊数量明显多于PBS组(图2)。在给药第6天，Tβ4组、PBS组、THY1组、THY2组、THY3组100倍视野毛囊数分别为(21.25±6.29)个、(8.75±2.99)个、(22.75±5.74)个、(20.00±3.65)个、(21.25±6.29)个，给药组多于PBS组，且THY1组与PBS组之间具有显著性差异(P<0.05)；在给药第18天，Tβ4组、PBS组、THY1组、THY2组、THY3组100倍视野毛囊数分别为(62.25±9.74)个、(45.75±4.43)个、(63.75±10.15)个、(63.75±10.91)个、(64.75±4.50)个，给药组明显多于PBS组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01) (图3)。

2.3 小鼠背部毛发长度变化情况

在给药第13天和第14天，THY1组、THY2组、THY3组毛长显著或极显著高于PBS组，而Tβ4组与PBS组间的差异无统计学意义；在给药第15天、第16天和第17天，给药组毛长均显著或极显著长于PBS组(P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.000 1) (图4)。

2.4 美洲大蠊胸腺素对毛发生长相关基因表达影响

在给药第6天，THY1组、THY2组和THY3组小鼠皮肤内β-catenin表达量均高于PBS组，且THY1组和THY3组与PBS组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)；在给药第12天，Tβ4组β-catenin表达量高于PBS组，但差异无统计学意义(P>0.05)；在给药第12天和第18天，给药组β-catenin表达量均低于PBS组(图5)。

在给药第6天，THY2组、THY3组和Tβ4组小鼠皮肤内的MMP-2表达量高于PBS组；在给药第12天和第18天，给药组MMP-2表达量均高于PBS组，且在给药第18天，THY2组与PBS组的差异有统计学意义(P<0.01) (图6)。

在给药第6天，给药组IGF-1表达量均高于PBS组；在给药第12天，THY1组和Tβ4组IGF-1表达量高于PBS组；在给药第18天，THY1组IGF-1表达量显著高于PBS组(P<0.05) (图7)。

3 讨论

毛囊的生长周期分为生长期、退行期和休止期(周乃慧，2008)。C57BL/6小鼠是常用来进行毛发生长观察的动物模型，躯干背部的黑色素细胞只存在于毛囊中(于萍等，2014)。小鼠毛囊在退行期时，黑色素生成减少，皮肤变为灰色(曾明辉，谭正怀，2008)。7周龄C57BL/6小鼠毛发生长开始进入休止期，黑色素的生成完全停止，背部皮肤为粉红色(邢喆等，2004；曾明辉，谭正怀，2008)。而当小鼠背部毛囊进入新的生长周期时，皮肤逐渐变黑，因此可以通过小鼠背部颜色的变化来推断小鼠毛发是否进入生长期。本实验发现，给药组小鼠皮肤变黑明显早于PBS组，毛发生长长度及毛囊数量显著高于PBS组，说明美洲大蠊胸腺素可以增加毛囊数量、促进毛发生长。

Wnt/β-catenin是生物体内一条保守的信号通路，在毛囊发生的起始阶段起到关键的作用(Chodankaretal.，2003)。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路中的关键调控因子，与Let-1相互作用，参与毛发基板的发育(Huelskenetal.，2001)、促进毛发生长与协调毛囊周期(Cadigan & Nusse，1997)。毛囊发育首先形成基板，进而进行形态发生(Huelskenetal.，2001)。Posthaus等(2002)发现，基板发生往往伴随β-catenin表达的上调，敲除β-catenin和Lef1基因的转基因小鼠出生后体表无毛、无胡须。Huelsken等(2001)同样发现敲除小鼠β-catenin基因，毛发生长受到抑制。本研究初步发现，在脱毛的C57BL/6小鼠背部涂抹美洲大蠊胸腺素，β-catenin表达水平在给药第6天明显高于PBS组，且高于Tβ4组，这说明β-catenin在脱毛小鼠背部毛囊发育前期发挥重要作用，美洲大蠊胸腺素可能通过促进β-catenin的表达进而促进小鼠的毛囊发育。

MMP-2是基质金属蛋白酶家族中的主要成员，仅在毛囊、巨噬细胞和汗腺中表达(高笑宇，2015)。Kumar等(2011)发现MMP-2会促进黑素细胞前体(成黑素细胞)从毛囊外根鞘的迁移，从而在毛球部积累并生成黑色素。高笑宇(2015)发现Tβ4可以促进MMP-2的表达从而改变相关信号通路的活性，促进毛囊发育和毛发生长。本研究首次探究并初步发现，除了在给药第6天THY1组小鼠皮肤内MMP-2表达量低于PBS组，其余给药组的均高于PBS组，表明美洲大蠊胸腺素可能通过提高小鼠体内的MMP-2表达来促进上皮细胞的迁移，促进毛囊的生长发育。

IGF-1是一种多功能细胞调控因子，是皮肤毛囊发育过程中的重要因子(Ben-Amitaietal.，2006)。Stenn等(1996)发现外源性的IGF-1能促进体外毛囊的生长，影响次级毛囊的形成和发育。王婷等(2013)发现IGF-1可通过刺激羊驼皮肤成纤维细胞的增殖而促进毛囊的生长发育。本研究发现，THY1蛋白处理的小鼠皮肤IGF-1表达量随时间变化增高；THY2和THY3处理后的小鼠皮肤IGF-1表达量在给药第6天最高，随时间变化降低。这说明不同胸腺素蛋白可能在小鼠毛发生长不同阶段影响小鼠皮肤IGF-1的表达，进而调节小鼠毛发生长。

综上所述，美洲大蠊胸腺素可以促进C57BL/6小鼠的毛发生长。推测美洲大蠊胸腺素可能通过提高β-catenin、MMP-2和IGF-1的表达来调控小鼠的毛囊发育与毛发生长。