近自然管理对橡胶林土壤细菌组成及多样性的影响*

李明美，全飞，孙树晴，兰国玉，杨川，吴志祥

(1.中国热带农业科学院 橡胶研究所，海南 海口 571101;2.海南大学 林学院，海南 海口 570228;3.农业农村部儋州热带作物科学观测试验站，海南 儋州 571737)

橡胶树(Heveabrasiliensis)是典型的热带经济作物，近年来东南亚地区橡胶树的种植面积在不断扩大[1-3]。海南岛的橡胶林分布广泛，约占海南岛总植被的四分之一，常规橡胶林已成为热带地区的主要植被类型[4]。橡胶林在区域生态平衡上有着重要作用，同时对于热带地区经济持续发展起着一定作用。1880年德国林学家Gayer第一次正式提出了“接近自然的林业”[5]，并于1898年率先提出了“人类尽可能按照森林的自然规律来进行林业活动”的近自然林业思想，尊重森林生态系统的自然发展规律，实现生产和生态可持续的有机结合[6]。通常人工林因为树种单一、结构简单，导致林分抵御病虫害的能力相对较差，所以近自然管理的试验与研究十分重要。兰国玉等[7]在海南省儋州市设立一个1 hm2的橡胶林固定样地进行动态监测橡胶林的多样性特征，结果表明该样地植物多样性迅速恢复，其多样性接近热带雨林。近自然管理后土壤微生物是否也在一定程度上增加，仍无相关报道。

橡胶林土壤微生物对于橡胶树的生长和产量等有一定影响，同时对于土壤的肥力、土壤中的固氮和分解作用都有着重要的影响[8]。目前对于地上部植物和动物等多样性的研究有很多，国内对橡胶林群落物种多样性已经开展了一些研究[9]，但对土壤中细菌组成及多样性的研究，特别是关于不同管理方式下橡胶林土壤细菌群落组成及多样性的研究很少。我国近年来对于自然林业抚育技术等方面开展大量研究与实践，如果能将近自然林理论应用在橡胶产业中，对于橡胶林生物多样性的恢复、实现天然橡胶产业的可持续发展都有很大的帮助。细菌作为自然界的分解者，是生态系统的重要组成部分，参与着生态系统中的物质循环。土壤中的细菌群落对植物生长有着重要的作用，土壤微生物多样性是土壤生态系统的一个生命特征[10]，对自然的物质循环具有重要意义。土壤细菌群落的组成和结构可以作为土壤生态系统的健康情况、生产力情况和环境干扰程度的新指标[11-12]。土壤中细菌的主要作用是分解土壤中的有机质，分解后的养分用于植物生长，土壤微生物对于物质循环和土壤有机质代谢起到重要的作用，是判断土壤肥力的重要指标之一，对于土壤微生物的研究，具有重要的意义[13-15]。

本研究通过对不同管理方式下橡胶林土壤中细菌的组成及多样性、土壤中微生物生物功能进行对比，探讨近自然管理方式对橡胶林土壤细菌群落的影响，以期为橡胶林近自然管理方式下生物多样性的恢复提供理论依据。

1 研究区概况与方法

1.1 研究区自然概况

试验区位于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场四队橡胶林。海南岛位于中国南端，儋州市地处海南岛的西北部，处于热带北缘，属热带季风气候，常年受季风气候影响，旱雨季分明，雨热同期，全年阳光充足，雨量充沛。儋州市全年平均气温为23.5 °C左右，最热月为7月，最冷月为1月，5—10月为雨季，11月至翌年4月为旱季，年平均降水量可达到1 639 mm，年降水量在1 000～2 600 mm之间。

1.2 研究方法

1.2.1 样地设置与基本情况

在海南省儋州市中国热带农业科学试验场四队橡胶林中选取1 hm2生长状况良好的橡胶林作为固定样地，进行近自然管理；另外在四队橡胶林选取1 hm2生长状况良好的常规橡胶林，进行对比研究。试验区内的橡胶树均为2005年种植，2013年开割。

样地内种植的橡胶树品种均为‘热研7-33-97’，该品种适应性良好，具有代表性。样地地形平缓，海拔在70～100 m。在近自然管理前，林下仅有少量散穗弓果黍(Cyrtococcumpatens)、短叶黍(Panicumbrevifolium)等禾本科植物，近自然管理后，许多植物恢复生长，但群落结构还是比较简单。

1.2.2 样品采集

在样地等距选取3个样点，作为3次重复，在每个样点选取长势良好的一棵橡胶树，树木之间距离50 m左右。采用四点取样法，以选取的橡胶树树干为圆心，0.5 m为半径，在圆上等距取4个点；去除表层5 cm的土壤，在5～20 cm土层采集土壤200 g；4个点土壤混匀，去除杂质并过筛；其中500 g土壤装入自封袋用于理化分析，再另取10 g土壤保存无菌离心管中，写好编号并低温保存，用于试验。于2014年3月、4月和7月分别进行取样，常规林和近自然管理林中都分别采集3个样本作为重复，将样品在实验室进行测试。

1.2.3 样品分析与数据处理

土壤理化性质和微生物功能测定参考鲁如坤[16]的土壤农业化学分析方法。土壤含水率采用鲜土进行烘干(105 ℃)法测定。土壤pH值使用pH计测定，土水比是1.0∶2.5。土壤有机质测定采用重铬酸钾-外加热法进行测定；全钾采用火焰光度计法测定；全磷采用钼锑抗比色法测定；全氮采用靛酚蓝比色法测定。

土壤微生物生物功能的测定方法如下：纤维素分解作用的测定采用埋布片法进行，用布条失重的百分数来表示；呼吸作用利用碱吸收滴定法进行测定，以每公斤的土壤在单位时间(24 h)内释放的二氧化碳(mg)数来表示；微生物生物量碳采用精氨酸培养法，通过测定提取液中的NH4+-N来计算得到微生物生物量碳；氨化作用强度测定采用土壤培养法，用培养后土壤氨态氮含量和培养前土壤氨态氮含量的差值得到氨化作用强度；硝化作用强度测定采用溶液培养法，将培养后的过滤液采用比色法测定NO2-N的含量得到硝化作用强度；固氮作用采用土壤培养法，用单位时间单位重量土壤的全N含量增量表示固氮强度。

同时进行Illumina公司MiSeq测序，从2%琼脂糖凝胶中提取扩增子，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen Biosciences,Union City，CA，U.S.)根据制造商的说明进行纯化，并使用QuantiFluor -ST(Promega，U.S.)进行定量。将纯化的扩增子等摩尔合并，并根据标准方案在Illumina MiSeq平台上进行配对末端测序(2×250)。

数据分析采用Excel和SPSS进行Duncan多重比较等分析和相关分析，得到结果进行作图。

2 结果与分析

2.1 常规林与近自然管理林土壤养分特征比较

从表1中可以看出，在常规橡胶林和近自然管理橡胶林的土壤理化性质和养分对比中，两者的pH值、有机质和全磷含量对比存在显著性差异。进行近自然管理后，土壤的pH值升高，所以常规橡胶林的土壤酸性更强。对橡胶林进行近自然管理后，土壤中有机质含量有所降低，但土壤的全磷含量增加。

表1 常规林与近自然管理林土壤养分对比

2.2 常规林与近自然管理林土壤微生物生物功能比较

从图1可以看出，常规橡胶林和近自然管理橡胶林的土壤微生物生物功能对比，微生物生物量碳、硝化作用和固氮作用都存在显著性差异；纤维素分解、呼吸作用和氨化作用不存在显著性差异。对橡胶林进行近自然管理后，土壤微生物的生物功能中，微生物生物量碳、氨化作用、硝化作用和固氮作用都出现下降现象；呼吸作用出现增加现象。其中微生物生物量碳、硝化作用和固氮作用下降现象明显。

图1 常规林和近自然管理林土壤微生物生物功能比较

2.3 常规林与近自然管理林土壤细菌组成及多样性比较

在门和科的水平上，对常规橡胶林和近自然管理橡胶林的土壤微生物丰富度进行对比，从图2可以看到，2种林分微生物物种组成在门水平和科水平均差异性不显著，但在图2a中，红色部分代表的酸杆菌门是常规林多于近自然管理林。

图2 常规林和近自然管理林土壤细菌在门和科水平上丰富度对比

不同季节中，在门的水平上，对常规橡胶林和近自然管理橡胶林的土壤微生物丰富度进行对比，从图3可以看到，图3a中2种林分细菌物种组成在旱季时差异较明显，物种组成上常规林的变形杆菌门、酸杆菌门、绿弯菌门均高于近自然管理林；近自然管理林的物种组成中，放线菌门、厚壁菌门高于常规林；图3b中，在旱季—雨季时，近自然管理林中的疣微菌门和酸杆菌门高于常规林，变形杆菌门低于常规林；图3c中，在雨季时，常规林的细菌组成中变形杆菌门和酸杆菌门高于近自然管理林。

图3 不同季节时常规林和近自然管理林土壤细菌门水平上丰富度对比

从图4可以看到，在OTU水平对两种橡胶林土壤细菌物种进行对比，2种管理方式下橡胶林的样本点不接近，说明近自然管理橡胶林和常规橡胶林中土壤细菌的物种组成差异不显著。

图4 常规林和近自然管理林土壤细菌OTU水平上丰富度对比

累计多样性分析曲线是在OTU水平用于描述对着样本量的加大，物种总量和核心物种数量的变化情况。图5a、图5b、图5c为不同季节时，常规林与近自然管理林的土壤细菌总量随着样本量的不断增加的变化规律，可以看出，在不同季节时，随着样本量的不断增加，常规林和近自然管理林的土壤细菌总量变化趋势相同，都是在不断增加。旱季时，常规橡胶林细菌物种总量高于近自然橡胶林；旱季—雨季时，2个橡胶林的细菌物种总量相同；雨季时，近自然橡胶林细菌物种总量高于常规橡胶林。从图5d可以看出，将各季节样本汇总进行分析时，近自然管理林和常规林中随着样本量不断增加，土壤细菌物种总量变化趋势相似，都是不断增加，并且近自然管理林土壤细菌物种总量始终高于常规林。

图5 常规林和近自然管理林土壤细菌OTU水平上γ多样性(伽玛多样性)对比

表2和图6是对常规林和近自然管理林的土壤细菌进行Alpha多样性对比，在OTU水平对2个林种土壤样品进行Alpha多样性对比，运用t检验，常规林和近自然管理林的土壤细菌的群落丰富度并没有明显的差别。

表2 常规林和近自然管理林土壤细菌OTU水平上Alpha多样性对比

图6 常规林和近自然管理林土壤细菌OTU水平上Alpha多样性对比

3 讨论与结论

3.1 近自然管理方式对橡胶林土壤养分特征及微生物生物功能的影响

根据已有研究可知，土壤的酸碱度对于土壤有机质有着十分重要的影响[17-18]，不同的土地利用方式会影响土壤微生物群落的功能实现[19-20]。土壤有机质含量是决定土壤细菌多样性的重要因素[21]。根据本研究结果可知，在对橡胶林进行近自然管理后，土壤pH值和全磷含量增加，有机质含量降低。由此可得，土壤的微生物差异不仅与地上植被的差异有关，与不同的土地利用方式也有关，这与已有的研究结果相一致。常规橡胶林的土壤微生物硝化作用、固氮作用高于近自然管理林。常规林土壤有机质高于近自然管理林，有机质可以供应土壤微生物所需的能量和养分，有利于微生物如固氮菌等的活动，所以固氮作用更高。根据中国科学院城市环境研究所相关研究结果，酸性土壤中硝化作用更高，本研究土壤理化性质的测定中得到，常规橡胶林土壤的pH值更低，因而其硝化作用高于近自然管理橡胶林。

3.2 近自然管理方式对橡胶林土壤细菌多样性的影响

根据土壤理化性质测定可知，常规林的土壤酸性比近自然管理林的更强。在门的水平上对比，常规橡胶林和近自然管理橡胶林的土壤细菌物种组成相同，常规林的酸杆菌门多于近自然管理林。因为酸杆菌更喜酸性土壤，所以常规林土壤中酸杆菌门相对更多。已有研究表明，长期施用化肥会使土壤pH值降低[22-23]，常规林与近自然管理林相比会更多的施用化肥，所以化肥的施用是造成常规林土壤酸性更强的原因之一。在旱季—雨季时，近自然管理林土壤中酸杆菌门高于常规林，与全年结果对比不同。多数研究表明，土壤中酸杆菌的丰度与土壤pH值呈负相关[24]，但也有研究发现，酸杆菌的相对丰度和土壤pH值的相关性不显著，还受其它环境因子的影响[25-27]。在旱季—雨季时由于含水量、N等因素的不同造成影响，使近自然管理林土壤中酸杆菌门更多。土壤全氮、全碳和全磷含量增加为氨氧化微生物的生长提供了充足的能源和碳源，促进了细菌数量的增加，是细菌数量增加的重要因素[28]。所以，橡胶林在进行近自然管理后，全磷含量增加，促进了细菌数量的增加。在OTU水平进行的橡胶林土壤细菌多样性研究可知，进行累计多样性分析时，常规林和近自然管理林细菌物种丰富度随着样本量增加变化趋势相同，都是在不断增加，但近自然管理林的土壤细菌物种数目始终高于常规林。植物物种丰度和植物功能多样性对土壤细菌群落的活性和多样性有成正比的影响[29]。兰国玉等[30]研究表明，近自然管理后橡胶林群落物种多样性较高，所以近自然管理后橡胶林土壤细菌丰富度更高。在OTU水平上进行的PCoA分析和Alpha多样性分析中，常规林和近自然管理林的土壤细菌多样性没有显著性差异。因此，对橡胶林进行近自然管理不会造成土壤中细菌组成和多样性发生很大改变，但会对土壤细菌多样性的恢复有一定帮助。研究表明季节是橡胶林土壤细菌组成与多样性的驱动因子之一，这与之前兰国玉等[30]的研究结果一致，但值得注意的是近自然管理对季节变化的响应是不一致的。

3.3 近自然管理方式对橡胶林群落微生物多样性的影响

常规橡胶林由于受人为生产活动的影响，群落内物种多样性比较低，经过研究调查发现，橡胶林实行近自然管理后，其群落物种多样性并不低[7]，更为重要的是近自然管理后橡胶林的产量并不低于常规管理橡胶林[31]。目前国内外对有关地上植物群落与微生物群落开展了大量研究，发现土壤细菌物种多样性受温度、水分、植物生长发育等条件的综合影响[32-33]，地上植物群落多样性和丰富度升高使细菌多样性相应增加[34]。植物可以影响微生物群落结构，植被通过影响土壤环境，从而影响土壤细菌群落结构和多样性，土壤细菌多样性与土壤上的植物群落多样性呈正相关[35]。本研究发现，对橡胶林进行近自然管理后，有利于土壤微生物多样性的提高，近自然管理对于橡胶林生物多样性的恢复有重要意义。

土壤微生物与全球生物化学循环、全球生态系统的稳定有着十分密切的关系，通过研究土壤微生物多样性的影响因素可了解土壤微生物和土壤环境条件的改变及人类对土壤的利用之间的联系，为农业可持续发展的研究和土壤生态环境的保护提供理论依据[36]。近自然管理不仅可以提高橡胶林的生物多样性，同时可以降低管理成本和人工成本，近自然管理方式在橡胶林中的应用对橡胶林生物多样性恢复和橡胶林的可持续发展都提供了重要的帮助。