枸橘生药学特征研究

兰金旭， 郭晓凯， 练从龙， 王锴乐， 陈随清

(河南中医药大学，河南 郑州 450046)

枸橘为芸香科植物枳Poncirustrifoliate(L.)Raf.的干燥未成熟果实。性温，味苦、辛，无毒；具有舒肝止痛、破气散结、消食化滞、除痰镇咳的功效，中医临床常用于理气。唐宋以前作枳实用[1-3]，现代仅福建、广东等地作枳壳和枳实用[4]。1991年版《河南省中药材标准》称其为豫香橼，含有黄酮、香豆素、生物碱、挥发油等成分[5-7]，其中柚皮苷和新橙皮苷可促进小鼠小肠推进[8]，枳属苷可抗炎[9]、抗幽门螺旋杆菌[10]和保护胃黏膜[11]。枸橘在全国大部分地方都有栽培，但果实多废弃，造成了资源浪费。本实验对枸橘进行了生药学研究，以期为药材质量标准的制定提供参考。

1 材料

BX53型正置荧光显微镜(日本Olympus公司)；SP-30E型全自动薄层色谱点样仪(北京市永光明医疗器械有限公司)；沃特世e2695高效液相色谱仪(美国沃特世公司)。甲醇、磷酸、乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(美国赛默飞世尔科技有限公司)；双蒸水(实验室制备)。新橙皮苷、柚皮苷(成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-18040707和MUST-18050808)。药材收集于河南、甘肃、安徽等地，共16批，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为芸香科植物枳Poncirustrifoliata(L.)Raf.的干燥果实。具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 性状鉴别 呈圆形厚片状，直径2～4 cm。外果皮棕黄色至褐色，有颗粒状突起，突起的顶端有凹点状油室，果梗痕明显。切面中果皮黄白色，光滑而稍隆起，厚0.1～0.5 cm，具有5～10瓣瓤瓣；内含多数种子，种子黄白色，长0.5～1.0 cm；质坚硬，气清香，微苦，酸，涩，见图1。不同产地性状略有差别，贵州安顺、广西桂林药材外果皮颜色呈棕褐色或褐色，颜色较深；山西晋城、甘肃文县、云南富民药材外果皮颜色呈黄棕色；河南禹州、安徽凤阳药材外果皮呈棕黄色；安徽亳州药材外果皮颜色兼有棕黄色和棕褐色；陕西西乡药材外果皮颜色兼有棕褐色和黄棕色。中果皮颜色以黄白色为主，仅贵州安顺2批为黄褐色。种子大小差别较小。

图1 枸橘药材性状鉴别图(甘肃文县)

2.2 显微鉴别 粉末黄白色或棕黄色。取少量粉末制成水合氯醛透化片，可观察到瓤囊细胞类圆形，细胞中多含草酸钙晶体；气孔环式，类圆形，副卫细胞5～9个；非腺毛单细胞，长100～300 μm，壁厚，光滑，基部稍弯曲；草酸钙方晶成行排列，散在晶体较多；导管多为螺纹，网纹。见图2。

1.瓤囊细胞 2.气孔 3.非腺毛 4.草酸钙结晶 5.导管图2 枸橘药材显微鉴别图

2.3 薄层鉴别 药材粉末加入80%乙醇(1∶10)60 ℃水浴提取40 min，放冷补足减失质量后过滤蒸干，残渣加入80%乙醇溶解作为供试品溶液[12]。另取柚皮苷、新橙皮苷加入80%乙醇制备成0.5 mg/mL对照品溶液。取柚皮苷溶液、各样品溶液2 μL点在同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)为展开剂，晾干后喷洒10%三氯化铝乙醇溶液，置于365 nm紫外灯下检视。取新橙皮苷溶液、各样品溶液2 μL点在同一聚酰胺膜薄层板上，以氯仿-甲醇-丙酮(15∶3.5∶1.5)为展开剂，晾干后喷洒10%三氯化铝乙醇溶液，置于365 nm紫外灯下检视[13]。结果发现薄层色谱上柚皮苷斑点、新橙皮苷斑点明显，供试品色谱与对照品色谱位置相同，所有点均能完全分开，见图3～4。

1.柚皮苷对照品 2.贵州安顺(第1批) 3.山西晋城 4.河南禹州 5.安徽亳州(第1批) 6.甘肃文县(第1批) 7.陕西西乡(第1批) 8.贵州安顺(第2批) 9.陕西西乡(第2批) 10.安徽亳州(第2批) 11.甘肃文县(第2批) 12.云南富民 13.贵州安顺(第3批) 14.安徽亳州 15.安徽凤阳 16.广西桂林 17.安徽亳州(第3批)图3 柚皮苷TLC色谱图

1.贵州安顺(第1批) 2.山西晋城 3.河南禹州 4.安徽亳州(第1批) 5.甘肃文县(第1批) 6.陕西西乡(第1批) 7.贵州安顺(第2批) 8.陕西西乡(第2批) 9.安徽亳州(第2批) 10.甘肃文县(第2批) 11.云南富民 12.贵州安顺(第3批) 13.安徽亳州 14.安徽凤阳 15.广西桂林 16.安徽亳州(第3批) 17.新橙皮苷对照品图4 新橙皮苷TLC色谱图

2.4 水分、灰分、浸出物检查 参考2015年版《中国药典》[14]四部中通则0832烘干法、通则2302、通则2201项热浸法进行水分、灰分和浸出物测定，16批不同产地枸橘药材含水量8.52%～12.12%，平均值10.81%；总灰分含量3.37%～6.02%，平均值4.10%；浸出物含量12.59%～16.84%，平均值14.80%。见表2。

表2 水分、总灰分、浸出物、各成分含量测定结果(%)

2.5 样品含量测定

2.5.1 色谱条件 安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.1%磷酸(20∶80)；检测波长283 nm。

2.5.2 对照品溶液制备 用甲醇溶解新橙皮苷、柚皮苷对照品，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得(柚皮苷、新橙皮苷质量浓度分别为385、306 mg/mL)。

2.5.3 供试品溶液制备 精密称取药材粉末，加入甲醇(1∶25)，75 ℃水浴回流1.5 h，放冷，补足减失质量，滤过，精密量取滤液10 mL，置于25 mL量瓶中定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.5.4 线性关系考察 精密吸取0.038 5、0.077 0、0.115 5、0.154 0、0.192 5 mg/mL柚皮苷对照品溶液各10 μL，以其色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=2×106X+54 834(r=0.999 6)。

精密吸取0.030 6、0.061 2、0.091 8、0.122 4、0.153 0 mg/mL新橙皮苷对照品溶液各10 μL，以其色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=279.36X-2 010.3(r=0.999 1)。

2.5.5 稳定性试验 精密称取同一药材粉末2.0 g，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.5.1”项条件下进样10 μL，各测定6次，测得柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为1.29%、2.62%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.6 精密度试验 按“2.5.2”项下方法制备对照品溶液，在“2.5.1”项条件下进样6次，每次10 μL，测得柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为0.51%、0.50%，表明仪器精密度良好。

2.5.7 重复性试验 精密称取同一药材粉末6份，每份2.0 g，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项条件下进样，测得柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为1.54%、2.92%，表明该方法重复性良好。

2.5.8 加样回收率试验 精密称取同一药材粉末6份(含柚皮苷3.23%、新橙皮苷1.65%)，每份2.0 g，加入100%水平对照品，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.5.1”项条件下进样，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.5.9 样品含量测定 16批药材中柚皮苷含量为3.61%～7.60%，平均值为4.8%，其中2批低于4%，10批为4%～5%，3批为5%～6%，仅有1批高于6%；新橙皮苷含量为1.28%～2.31%，平均值为1.79%，其中3批超过2%，13批为1.28%～1.97%。

3 讨论

枸橘作为地方药材使用广泛，尚未建立明确质量标准。本研究可为枸橘鉴别和质量标准的制订建立提供参考。