姜黄中1个新的降碳没药烷型倍半萜

舒洪珍， 谯明鸣， 熊 亮， 彭 成， 刘 菲*， 郭 力*

(1.成都中医药大学药学院，教育部中药材标准化重点实验室，四川 成都 611137；2.西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都 611137)

姜科植物姜黄CurcumalongaL.，是著名的川产道地药材，能活血行气、通经止痛[1]，在中医临床上广泛用于妇科、伤科、痹症，疗效显著，是历代医家治疗血瘀证的常用中药。姜黄除了治疗妇科疾病(如痛经、月经不调)外，还用于动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌肥厚等心血管疾病[2-3]，其化学成分主要分为姜黄素类和萜类，其中萜类又以倍半萜类成分为代表，目前从中分离得到的该类成分达20多种，主要包括吉马烷型、愈创木烷型、长松针烷型、桉烷型、没药烷型、蒈烷型、榄香烷型、苍耳烷型，其中没药烷型倍半萜数量最多[4-6]。课题组前期采用现代色谱分离纯化技术从姜黄中分离获得了一系列没药烷型倍半萜以及新颖骨架倍半萜类化合物，发现倍半萜类化合物舒张血管活性显著[7-8]。在此基础上，本实验利用多种分离纯化手段对姜黄中倍半萜类成分进行研究，并通过离体大鼠胸主动脉模型对所得化合物进行活性评价，以期获得更多的新颖活性成分，丰富姜黄的化学成分库，为新药的开发利用提供来源。

1 材料

1.1 仪器与试剂 旋光测定仪(安东帕MCP 200旋光仪)；红外光谱仪，Agilent 1220、Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Bruker-600核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；Waters Synapt G2高分辨质谱仪(美国Waters 公司)；圆二色谱仪(英国Chirascan-plus公司)；Gradient Former B-687中压液相色谱仪(瑞士Buchi公司)；旋转蒸发仪(亚荣生化仪器有限公司)；BP221S电子天平(德国Sartorius公司)；离体组织器官恒温灌流系统 (澳大利亚PL3508B6/C-V Panlab 8 Chamber Organ Bath System)；可调式移液器 (美国Thermo Fisher Scinentific公司)；Zorbax SB-C18色谱柱 (250 mm× 9.4 mm, 5 μm，美国Agilent公司)；薄层色谱硅胶GF254(青岛海洋化工厂)；柱色谱硅胶(200～300目，青岛海洋化工厂)；Sephadex LH-20(瑞典Amershan Pharmacia公司)。甲醇(色谱级，美国Tedia公司)；乙醇(色谱级，美国Fisher公司)；其他所用试剂均为分析纯(成都市科隆化学品有限公司)。

1.2 动物 清洁级SD大鼠，雌雄不限，体质量(200 ± 20)g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，动物生产许可证号SCXK (川) 2013-24，检疫后用，饲养温度21～27 ℃，相对湿度(50±5)%, 昼夜光照及通风环境自然调节。

1.3 样品 姜黄购于四川新荷花中药饮片有限公司，经成都中医药大学药用植物研究室李敏教授鉴定为姜黄CurcumalongaL.的干燥根茎，标本(CL-20160803)保存于成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所。

2 方法

2.1 提取与分离 姜黄(50 kg)加95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取3次，每次8倍量溶剂，第1次3 h，第2次2 h，第3次1.5 h，合并提取液，50 ℃减压浓缩得半固体流浸膏7 kg。将浸膏混悬于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯反复萃取，将萃取液于50 ℃减压浓缩，得石油醚部位2 kg、乙酸乙酯部位3 kg。乙酸乙酯部位经硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯(1∶0、7∶3、4∶6、0∶1)洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似组分，减压浓缩至稠浸膏，并依次编号为A～F，浸膏B(500 g)经硅胶柱，用二氯甲烷-乙酸乙酯(100∶1～0∶1)梯度洗脱，经薄层色谱法检视，合并相似洗脱馏分并减压浓缩，得16个馏分，依次编号为Fr.1～Fr.16。Fr.6馏分进一步经中压液相分离，以甲醇-水(30%～100%)梯度洗脱，得到12个馏分(Fr.6-1～Fr.6-12)，Fr.6-1经制备薄层色谱石油醚-乙酸乙酯(10∶1)分离得到Fr.6-1-1、Fr.6-1-2，Fr.6-1-1经反相半制备液相色谱(81%甲醇-19%水)纯化得化合物1(2.9 mg)。

3 结构鉴定

为了进一步确定化合物1结构，进行了2D-NMR实验。1H-1H COSY谱显示，H-5与H2-6相关，H2-2与H2-3相关,见图1。在HMBC谱中，H3-11和C-3、C-4、C-5相关，H2-2和C-1、C-3、C-4、C-6相关，确证C-1至C-6形成4位甲基取代的六元环；1H-1H COSY谱显示，H3-10/H-7/H2-8相关，见图1。在HMBC谱中，H3-10和C-1、C-7、C-8相关，H2-8和C-1、C-7、C-9、C-10相关，结合不饱和度判断，确证C-1、7、8、9位形成7位甲基取代的五元内酯环。比对文献[9]发现，化合物1与文献中的4,8-dimethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-7-en-2-one平面结构相同，但文献中为合成的异构体混合物，而且未对其绝对构型进行确定。

进一步通过NOSEY谱确定其相对构型，发现信号H2-2和H3-10相关，表明两者位于同侧，而与H2-6位于异侧。进而通过计算ECD对化合物1进行绝对构型确证，使用IEFPCM模型在甲醇中针对(1R,7S)-1和(1S,7R)-1在CAM-B3LYP/DGDZVP水平计算得到的ECD谱见图2，可知(1R,7S)-1的ECD谱与实验ECD谱非常吻合。因此，将1的绝对构型确定为1R,7S，命名为(1R,7S)-4,7-二甲基-12-氧杂螺[4.5]癸烷-4-烯-9-酮，具体数据见表1。

表1 化合物1的1H-NMR(600 MHz, 丙酮-d6)和13C-NMR数据(150 MHz, 丙酮-d6)

图1 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相关Fig.1 Key HMBC and1H-1H COSY correlations of compound 1

图2 化合物1的实验和计算ECD谱Fig.2 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

4 舒张血管活性评价

4.1 溶液制备

4.1.1 K-H液(Kreb’-Henseleit solution) 取NaCl 13.87 g、KCl 0.7 g、KH2PO40.32 g、MgSO40.28 g、NaHCO34.2 g、Glucose 3.64 g、EDTA 0.018 g、CaCl20.56 g，加超纯水至2 000 mL，即得(pH=7.4)，现配现用。

4.1.2 样品溶液 精密称取化合物1适量，加二甲基亚砜配制成50 μmol/mL，即得。

4.2 大鼠胸主动脉血管环制备 取出大鼠胸主动脉，剪成3～5 mm的血管环，采用离体组织灌流模型和PowerLab数据分析系统采集记录离体血管环张力的变化。浴槽内含有K-H液，温度恒定在37 ℃，持续通95%O2+5% CO2混合气体，待血管环平衡60 min后，用KCl (60 mmol/L) 连续刺激血管环至少2～3次。每次刺激后，K-H液连续冲洗3次，每次5 min，恢复到基础状态后稳定30 min。当连续相同刺激所引起的血管收缩幅度小于10%时，往浴槽内加入KCl (60 mmol/L) 预收缩胸主动脉环，血管收缩张力达到坪值时，累积加入5个浓度 (0.25、0.75、2.5、7.5、25 μmol/mL) 的化合物1，观察浓度与舒张效应曲线，比较不同浓度化合物对KCl (60 mmol/L) 预收缩血管环的舒张作用。

4.3 结果 从现代医学角度而言，大多数心血管疾病患者都存在微循环障碍、血流动力学异常等现象，临床治疗以扩张血管，加强血液循环与促进血液流通为主。现代药理研究表明，姜黄具有改善血液流变学、抗凝血、舒张血管等作用[10-11]；课题组前期发现，姜黄中倍半萜具有舒张血管作用。因此，本实验研究化合物1对KCl预收缩的胸主动脉环舒张作用，发现它并无显著活性。

5 讨论

本实验采用多种分离手段从姜黄中获得一个新的降碳没药烷型倍半萜，并通过计算ECD确定其绝对构型，此化合物在姜黄中首次被报道。姜黄中含有较多没药烷型倍半萜，但是在支链上降碳的没药烷型倍半萜较为少见，除了课题组前期报道的一对降碳没药烷型倍半萜对映异构体外，未有其他报道。除此之外，在其他植物中分离得到的降碳没药烷型倍半萜也很少见[12-13]。另外，化合物1在降碳后C-9与C-1形成一个五元不饱和内酯环，是一种比较特殊的环合方式。在姜黄中发现较多的环合方式通常在C-8或者C-9与C-2之间通过醚键连接[7,14]。尽管课题组前期发现姜黄中没药烷型倍半萜以及新颖骨架倍半萜均有较好的舒张血管活性，但是本实验研究结果表明此化合物对KCl预收缩的胸主动脉环无舒张作用。因此猜测没药烷型倍半萜在经过降碳后，其舒张血管活性也会受影响。

姜黄作为一种药食同源的植物，被广泛关注。但目前对姜黄的研究无论在化学成分还是在药理活性方面都集中在姜黄素类成分，对其另外一大类成分—倍半萜类成分研究较少。本研究成果丰富了对姜黄倍半萜类成分的认识，补充了姜黄的化学成分库，可为今后其倍半萜成分的研究提供参考。