miR-128-3p通过调控Notch1表达影响子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡①

顾晓荔 任晓爽 廖予妹（郑州大学第二附属医院妇产科，郑州450014）

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其发病率逐年增长及年轻化[1］。近年来，随着医疗水平的进步，EC的治疗取得巨大进步，但晚期患者易复发和转移，预后较差[2］。目前，EC的发病机制尚未明确。因此，探讨EC发生、发展的分子机制并寻找基因治疗靶点对于EC的治疗和预后改善具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类小分子非编码RNA，通过与靶信使RNA（mRNA）的3'非翻译区（3'untrans‐lated region，3'UTR）靶向结合，降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻译，进而调控靶基因的表达，影响细胞的生长、凋亡和分化等生命过程[3］。研究显示，miR-128-3p参与调控肝癌、食管癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移，在肿瘤的发生和发展过程中起重要作用[4-6］。但目前，miR-128-3p对EC细胞增殖和凋亡的影响还未知。生物信息学软件预测显示，Notch1的3'UTR存在与miR-128-3p结合的连续位点，提示Notch1是miR-128-3p的靶基因。Notch1是一种Ⅰ型跨膜蛋白，在肿瘤细胞生长、增殖和凋亡过程中起重要调控作用[7］。研究显示，Notch1蛋白在EC组织中阳性表达率升高，其表达与患者肿瘤淋巴结转移、分化程度等临床病理特征密切相关，参与调控EC细胞的增殖和凋亡[8-9］。目前，miR-128-3p能否通过调控Notch1表达影响EC细胞的增殖和凋亡也还未知。本研究首先检测了EC细胞系中miR-128-3p和Notch1表达水平，然后探讨了过表达miR-128-3p或低表达Notch1对EC细胞增殖和凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响，并验证了miR-128-3p能否通过调控Notch1表达影响EC细胞增殖和凋亡，以期为EC的靶向分子治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人子宫内膜血管内皮细胞hEEC、EC细胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA（中国科学院上海细胞库）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RP‐MI1640培养基（美国Hycolne公司）；四甲基噻唑蓝（methylthiazoletrazolium，MTT）、LipofectamineTM2000试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；胰蛋白酶（美国Sigma公司）；Trizol试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人Notch1、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）和活化的半胱天冬酶-3（cleaved-caspase-3）多克隆抗体（美国Abcam公司）；兔抗人β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（Jackson公司），膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；miR-128-3p模拟物（mimics）及阴性序列、miR-128-3p抑制剂及阴性序列、Notch1的小干扰RNA（si-Notch1）及乱序无意义阴性序列（si-NC，广州锐博生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 子宫内膜血管内皮细胞hEEC、EC细胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA均用含10%FBS的RPMI1640培养基于培养箱中（37℃、CO2体积分数5%、湿度97%）培养。每隔2 d更换1次新鲜的培养基。待细胞融合至80%～90%时，0.25%胰蛋白酶溶液消化，进行传代培养。

1.2.2 Ishikawa细胞转染和分组 对数增殖期的Ishikawa细胞，以1×105个/孔接种于6孔板中。待细胞融合至60%时，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行转染。分别将miR-128-3p mimcs（miR-128-3p组）及阴性序列（miR-NC组）、miR-128-3p抑制剂（anti-miR-128-3p组）及阴性序列（anti-miR-NC组）、Notch1的小干扰RNA（si-Notch1）及乱序无意义阴性序列（si-NC）转染至Ishikawa细胞。转染12 h后，更换新鲜培养基，继续培养至48 h。收集细胞，RT-qPCR检 测miR-128-3p或Western blot检 测Notch1蛋白水平以评价转染效果。

1.2.3 RT-qPCR检测细胞中miR-128-3p和Notch1 mRNA表达 Trizol试剂提取细胞中总RNA，并逆转录为cDNA。以cDNA为模板，行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃5 min，95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共35个循环。miR-128-3p上游5'-GGAATTCAAC‐CAACTGTCAATAACTGGAG-3'，下游5'-CGGGATC‐CAATTTGTCATCCAAATCTACTTTGG-3'；Notch1上游5'-CGTGTGAACCCGTAGGCGCC-3'，下游5'-GGCCAACGTGTGCAAGCGACGGC-3'；U6上游5'-TGAACGCCGAGGGTGAGTGTCG-3'，下 游5'-CGGAAC‐GTGACGTGTGGCGTACG-3'；GAPDH上 游5'-GCGATAAGTGCTGAGCTGCTC-3'，下游5'-GTTGACGC‐GAACTGACGTGT-3'。miR-128-3p以U6为内参，Notch1以GAPDH为内参，2−ΔΔCt法计算miR-128-3p和Notch1 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 MTT检测Ishikawa细胞增殖 转染后的各组Ishikawa细胞，以5×103个/孔细胞接种于96孔板中，培养箱中培养48 h后，每孔加入20 µl浓度为5 g/L的MTT，继续孵育4 h。弃去培养基，每孔加入150 µl二甲基亚砜，反应5 min，混匀后于酶标仪490 nm处测定吸光度值（A）。每组设置3个复孔，实验重复3次，取平均值。细胞存活率（%）=A实验组/A对照组×100%。

1.2.5 流式细胞仪检测Ishikawa细胞凋亡 转染后的各组Ishikawa细胞，以1×104个/孔细胞接种于24孔板中，培养箱中培养48 h后，胰蛋白酶消化，收集细胞。取1.0×106个细胞，加入适量预冷的PBS清洗细胞2次。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，加入400 µl结合缓冲液，轻轻吹打混悬细胞。加入10 µl Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。加入5 µl PI，室温避光孵育5 min。最后再加入100 µl结合缓冲液，涡旋混匀后流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 Western blot法检测细胞中Notch1、cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白表达 RIPA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，4℃、12000 r/min离心5 min，保留上清液。BCA法测定上清中蛋白浓度对蛋白进行定量。取适量蛋白溶液，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，以每孔20 µg蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，湿转至聚偏乙烯二氟膜，并置于5%脱脂牛奶中封闭2 h。分别加入稀释后的Notch1（1∶500）、cyclinD1（1∶100）、cleaved-cas‐pase-3（1∶1000）和β-actin（1∶8000）抗体，4℃冰箱孵育过夜。洗膜后，加入辣根过氧化酶标记的二抗（1∶5000），室温孵育1 h。洗膜后，滴加化学发光试剂ELC，避光显影后使用ZF-258型凝胶成像系统（上海嘉鹏科技有限公司）曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。目的蛋白的相对表达水平以期蛋白条带灰度值与内参β-actin蛋白条带灰度值的比值表示。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-128-3p与Notch1靶向关系 Starbase软件预测显示，Notch1的3'UTR含有与miR-128-3p结合的连续位点。采用PCR技术扩增含miR-128-3p结合位点的Notch1的3'UTR序列，将其克隆至psiCHECK-2质粒中，构建Notch1野生型载体（WT-Notch1）。利用基因定点突变技术将结合位点突变后，克隆至psiCHECK-2质粒，构建Notch1突变型载体（MUT-Notch1）。Ishi‐kawa细胞1×105个/孔接种于6孔板中。待细胞融合至60%时，分别共转染WT-Notch1、MUT-Notch1与miR-128-3p mimic或miR-NC至Ishikawa细胞。转染12 h后，收集细胞，检测各组荧光素酶活性。具体操作参照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书，各组的荧光素酶活性以荧光虫活性与海肾荧光强度的比值表示。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0软件对实验数据进行分析。符合正态分布的计量资料以±s表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EC细胞系中miR-128-3p和Notch1表达水平与hEEC细胞比较，EC细胞系HEC-1A、Ishikawa和AN3CA中miR-128-3p表 达 水平 降低（P<0.05），Notch1 mRNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）。见图1和表1。

图1 Western blot检测EC细胞系中Notch1蛋白表达Fig.1 Western blot detected expression of Notch1 protein in EC cell lines

表1 EC细胞系中miR-128-3p和Notch1表达水平（±s，n=9）Tab.1 Expression levels of miR-128-3p and Notch1 pro⁃tein in EC cell lines（±s，n=9）

Note：Compared with hEEC group，1）P<0.05.

Groups hEEC HEC-1A Ishikawa AN3CA F P miR-128-3p 1.00±0.100.32±0.031）0.22±0.021）0.40±0.041）344.0930.000 Notch1 mRNA 1.02±0.113.02±0.301）3.76±0.381）2.76±0.281）149.1270.000 Notch1 protein 0.35±0.040.76±0.081）0.98±0.101）0.85±0.091）102.1150.000

2.2 过表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响 miR-128-3p组Ishikawa细胞中miR-128-3p水平高于miR-NC组（P<0.05），说明miR-128-3p mimics转染成功，Ishikawa细胞中miR-128-3p过表达。与miR-NC组比较，miR-128-3p组Ishikawa细胞存活率和cyclinD1蛋白水平降低（P<0.05），细胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平升高（P<0.05）。见图2和表2。

图2 高表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响Fig.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells

表2 高表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

表2 高表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of high expression of miR-128-3p on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p t P miR-128-3p 1.00±0.103.22±0.321）19.8650.000 CyclinD11.21±0.120.45±0.051）17.5380.000 Cleaved-caspase-30.36±0.040.88±0.091）15.8390.000 Cell viability（%）100.85±10.0861.24±6.121）10.0770.000 Apoptosis rate（%）6.43±0.6420.19±2.021）19.4810.000

2.3 低表达Notch1对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响 si-Notch1组Ishikawa细胞中Notch1蛋白水平低于si-NC组（P<0.05），说明Notch1小干扰RNA转染成功，Ishikawa细胞中Notch1表达降低。与si-NC组比较，si-Notch1组Ishikawa细胞存活率和cyclinD1蛋白水平降低（P<0.05），细胞凋亡率和cleaved-cas‐pase-3蛋白水平升高（P<0.05）。见图3和表3。

图3 Western blot检测Notch1、cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表达Fig.3 Western blot detected expressions of Notch1，cy⁃clinD1 and cleaved-caspase-3 proteins

表3 低表达Notch1对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of low expression of Notch1 on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

表3 低表达Notch1对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of low expression of Notch1 on proliferation and apoptosis of Ishikawa cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Groups si-NC si-Notch1 t P Notch10.96±0.100.35±0.041）16.9910.000 CyclinD11.18±0.120.40±0.041）18.4990.000 Cleaved-caspase-30.38±0.040.80±0.081）14.0870.000 Cell viability（%）100.76±10.0752.19±5.221）12.8460.000 Apoptosis rate（%）6.51±0.6522.37±2.241）20.4000.000

2.4 miR-128-3p靶向调控Notch1表达 Starbase软件预测显示，Notch1的3'UTR含有与miR-128-3p结合的连续位点（图4A）。双荧光素酶活性检测显示，miR-128-3p mimics与WT-Notch1共转染组荧光素酶活性低于miR-NC与WT-Notch1共转染组（P<0.05），而miR-128-3p mimics与MUT-Notch1共转染组与miR-NC与MUT-Notch1共转染组相比荧光素酶活性无显著性差异（P>0.05），说明miR-128-3p可与Notch1的3'UTR靶向结合。miR-128-3p组Notch1蛋白水平低于miR-NC组（P<0.05），anti-miR-128-3p组Notch1蛋白水平高于anti-miR-NC组（P<0.05），进一步说明miR-128-3p在Ishikawa细胞中靶向负调控Notch1表达。见图4、表4、表5。

图4 miR-128-3p靶向调控Notch1表达Fig.4 miR-128-3p targeted regulation of Notch1 expres⁃sion

表4 双荧光素酶活性检测结果（±s，n=9）Tab.4 Results of dual luciferase activity detection（±s，n=9）

表4 双荧光素酶活性检测结果（±s，n=9）Tab.4 Results of dual luciferase activity detection（±s，n=9）

Note：Compared with the miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p t P Relative luciferase activity WT-Notch11.00±0.100.42±0.041）16.1550.000 MUT-Notch11.08±0.111.05±0.120.5530.588

表5 miR-128-3p对Notch1蛋白表达的影响（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-128-3p on expression of Notch1 pro⁃tein（±s，n=9）

表5 miR-128-3p对Notch1蛋白表达的影响（±s，n=9）Tab.5 Effect of miR-128-3p on expression of Notch1 pro⁃tein（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with antimiR-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p anti-miR-NC anti-miR-128-3p F P Notch10.95±0.100.36±0.041）1.02±0.111.36±0.142）143.5770.000

2.5 过表达Notch1可逆转过表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响 与miR-128-3p+pcDNA-NC组 比 较，miR-128-3p+pcDNA-Notch1组Ishikawa细胞存活率、Notch1和cyclinD1蛋白水平升高（P<0.05），细胞凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白水平降低（P<0.05）。见图5和表6。

图5 Western blot检测Notch1、cyclinD1、cleaved-caspase-3蛋白表达Fig.5 Western blot detected expressions of Notch1，cyclinD1 and cleared-caspase-3 proteins

表6 过表达Notch1可逆转过表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Overexpressing Notch1 reversed effect of overexpressing miR-128-3p on Ishikawa cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

表6 过表达Notch1可逆转过表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响（±s，n=9）Tab.6 Overexpressing Notch1 reversed effect of overexpressing miR-128-3p on Ishikawa cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

Note：Compared with miR-128-3p+pcDNA-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-128-3p+pcDNA-NC miR-128-3p+pcDNA-Notch1 t P Notch10.40±0.040.82±0.081）14.0870.000 CyclinD10.43±0.041.02±0.111）15.1220.000 Cleaved-caspase-30.89±0.090.48±0.051）11.9470.000 Cell viability（%）62.10±6.2190.01±9.011）7.6520.000 Apoptosis rate（%）20.28±2.0310.11±1.011）13.4560.000

2.6 过表达Notch1可逆转过表达miR-128-3p对Ishikawa细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响 与miR-NC组比较，miR-128-3p组Ishikawa细胞β-catenin蛋白水平降低（P<0.05）。与miR-128-3p+pcDNANC组比较，miR-128-3p+pcDNA-Notch1组β-catenin蛋白水平升高（P<0.05）。见图6和表7。

表7 Western blot检测β-catenin蛋白表达（±s，n=9）Tab.7 Western blot detected β-catenin protein expression（±s，n=9）

表7 Western blot检测β-catenin蛋白表达（±s，n=9）Tab.7 Western blot detected β-catenin protein expression（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05；compared with miR-128-3p+pcDNA-NC group，2）P<0.05.

Groups miR-NC miR-128-3p miR-128-3p+pcDNA-NC miR-128-3p+pcDNA-Notch1 F P β-catenin 0.77±0.080.30±0.031）0.27±0.020.65±0.072）179.3100.000

3 讨论

miRNA的长度约为18～25个核苷酸，在转录后调控靶基因的表达，影响肿瘤的发生、发展。miR-128-3p是近年来新发现的一种miRNA。CHEN等[10］研究显示，间变性甲状腺癌细胞和组织中miR-128-3p表达水平降低，过表达miR-128-3p可降低癌细胞活力，并诱导细胞凋亡。FU等[11］研究显示，miR-128-3p在胶质瘤组织中表达降低，过表达miR-128-3p通过靶向抑制gremlin1表达抑制胶质瘤细胞活性。ZHAO等[12］研究显示，过表达miR-128-3p通过靶向抑制LIM结构域激酶1表达抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。目前，还未见miR-128-3p影响EC细胞生物学行为的相关报道。

本研究显示，miR-128-3p在EC细胞系中表达降低，提示miR-128-3p作为促癌基因参与该疾病的发生发展。通过转染miR-128-3p mimics构建过表达miR-128-3p的Ishikawa细胞，结果显示，过表达miR-128-3p后，Ishikawa细胞存活率降低，凋亡率升高，提示过表达miR-128-3p抑制Ishikawa细胞增殖，促进细胞凋亡。cyclinD1是细胞周期调控蛋白，促进细胞由G1期向S期转变，加速细胞增殖[13］。cas‐pase-3是caspase级联反应的关键调控蛋白，其活化后促进细胞凋亡[14］。本研究显示，过表达miR-128-3p可降低Ishikawa细胞中cyclinD1蛋白表达，促进活化的caspase-3蛋白表达，提示miR-128-3p通过调控cyclinD1和活化的caspase-3蛋白表达影响Ishikawa细胞的增殖和凋亡。为了进一步探讨miR-128-3p影响EC细胞增殖和凋亡的作用机制，本研究生物信息学遇见预测显示，Notch1可能是miR-128-3p的靶基因。本研究通过双荧光素酶活性检测证实了miR-128-3p可与Notch1的3'UTR靶向结合。此外，上调Ishikawa细胞中miR-128-3p表达后，Notch1蛋白表达降低，而下调miR-128-3p表达后，Notch1蛋白表达升高，进一步说明miR-128-3p靶向负调控Notch1表达。

Notch1是Notch受体家族成员之一，在胰腺导管腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤中发挥促癌作用[15-16］。本研究结果显示，EC细胞系中Notch1 mRNA和蛋白表达升高，低表达Notch1可抑制EC细胞增殖，并诱导细胞凋亡，与相关研究结果一致，提示Notch1作为促癌基因参与EC发生发展，靶向抑制其表达对于该疾病的治疗具有重要意义[9］。本研究还显示，过表达Notch1逆转了过表达miR-128-3p对Ishikawa细胞增殖和凋亡的影响，提示过表达miR-128-3p通过靶向抑制Notch1表达，进而抑制Ishikawa细胞增殖，并促进细胞凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路的激活可引起β-catenin转位至细胞核，激活下游靶基因如cyclinD1、c-myc等表达，从而参与肿瘤的发生、发展。如彭宁等[17］研究显示，沉默肝癌细胞中ZNF674-AS1的表达可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌细胞的增殖，并诱导细胞凋亡。研究已表明，抑制Wnt/βcatenin信号通路的激活可抑制EC细胞增殖、迁移和侵袭[18-19］。本研究结果显示，过表达miR-128-3p可降低Ishikawa细胞中β-catenin和cyclinD1蛋白表达，而过表达Notch1逆转了过表达miR-128-3p对Ishikawa细胞中β-catenin和cyclinD1蛋白表达的抑制作用，提示过表达miR-128-3p通过抑制Notch1表达，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活影响Ishikawa细胞的增殖和凋亡。

综上所述，miR-128-3p在EC细胞中呈低表达，过表达miR-128-3p可抑制EC细胞增殖，并促进细胞凋亡，其可能通过靶向抑制Notch1表达及Wnt/βcatenin信号通路的激活发挥作用，是EC治疗的潜在分子靶点。