DNA-PK抑制剂联合溶瘤病毒增强对肝癌的抗肿瘤活性研究①

吴育民 杜端明 刘春霖 洪跃飞 江磊 昌罗伟 芝彭尧 JOHN Bell

（深圳市第二人民医院介入治疗科，深圳518000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是男 性癌症相关死亡的第二大原因，每年在全球范围内夺走超过70万人的生命［1-2］。虽然手术切除、肝移植和消融治疗可以治愈早期疾病，但通常晚期疾病的最终和主要治疗方法是系统性药物治疗［3］。传统化疗在晚期肝癌患者中的应答率很低。索拉非尼已被公认为HCC患者的标准系统治疗方法，然而，肿瘤应答率并不令人满意［4］。因此，迫切需要新的策略来提高肝癌的治疗反应。

溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）是一种自我扩增的癌症生物疗法，可以在不损害正常组织的情况下摧毁恶性肿瘤［5］。OV疗法是治疗肝癌的一种潜在的有吸引力的策略［6］。水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV），在外周实体瘤模型中取得了强大的抗肿瘤效果，之前的研究已经产生了新型VSV突变体VSVΔ51，以努力提高VSV在OV治疗中的安全性［7-8］。这种病毒在VSV M蛋白的第51位有1个氨基酸缺失，通过阻止病毒阻断宿主细胞转录和核质运输，包括干扰素（IFN）的产生，巩固其治疗指数［9］。感染VSVΔ51后，IFN途径完整的非恶性细胞得到保护，而失去IFN反应能力的恶性细胞被裂解［10］。

尽管一些口服OV治疗癌症的临床前研究仍得到极大关注，但在临床试验中，OV的治疗效果达不到基于临床前模型的疗效预期［11］。因此，通过一些药物与OV联合或许可能是优化其肿瘤细胞杀伤的有效策略。在本研究中，筛选了多种通过不同机制抑制肿瘤生长的小分子药物与VSVΔ51进行联合，观察此组合对肿瘤的抑制活性。研究发现具有DNA-PK抑制能力的M3814可以显著提高VSVΔ51的溶瘤活性，并表明这种增效作用是通过增强肿瘤细胞的内质网应激实现的。实验结果表明，DNAPK抑制剂M3814联合VSVΔ51或许可以为肝癌的治疗提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系人肝癌细胞Huh-7及Vero细胞获取于美国模式菌种保藏库（ATCC）。均培养在添加10%FBS的DMEM培养基中，在37℃、5%CO2条件下生长。

1.1.2 主要试剂MTT及二甲基亚砜购自美国Sigma公司，组织裂解液购自美国Thermo Scientific公司，GAPDH购自上海优宁维生物科技有限公司，anti-p-JNK购自CST公司，anti-E1及anti-caspase 12购自Abcam公 司，anti-DNA-PKcs购自R&D公 司。LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。特异性siRNA和对照siRNA均购自苏州金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒的获取及滴度确定VSVΔ51是先前描述的印第安纳VSV血清型的重组衍生物。该病毒由JOHN Bell博士和DAVID Stojdl博士（渥太华健康研究所）提供。VSVΔ51在Vero细胞中增殖，并且通过Vero细胞上的标准空斑分析方法定量病毒滴度［12］。

1.2.2 RNA沉默Huh-7细胞汇合度达到80%时进行转染。采用LipofectamineTM2000转染试剂盒，分别将对照siRNA，特异性siRNA转染至Huh-7细胞，转染6 h后更换为含DMEM完全培养基继续培养48 h后进行后续实验。

1.2.3 靶细胞存活实验Huh-7细胞接种在96孔板中，5 000个/孔细胞，加入100 μl培养基。按照MOI值为0.01 PFU/个加入VSVΔ51，同时分别加入不同浓度的4种抗肿瘤机制不同的小分子化合物，DNA-PK抑制剂M3814，EGFR酪氨酸激酶抑制剂OSI-420，PI3K通路抑制剂ZSTK474以及c-Met抑制剂SGX523处理后，向细胞中加入MTT（终浓度1 mg/ml），在37℃继续培养4 h。去除含MTT的培养基，将MTT沉淀物溶解于100 μl DMSO中。使用酶标仪在570 nm处测定吸光度。细胞存活率=［OD570（实验组）/OD570（对照组）］×100%。

1.2.4 Western blot实验将各组肿瘤组织放在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中匀浆，提取蛋白并进行BCA定量。通过12%SDS-PAGE分离蛋白。电泳结束后，进行转膜，之后在5%脱脂奶粉溶液中封闭，并在4℃下与一抗（1∶1 500）孵育过夜。用TBST室温下洗涤3次后，将PVDF膜与HRP山羊抗兔或抗小鼠二抗（1∶20 000）在室温下孵育1.5 h。室温下TBST洗涤3次后进行曝光。使用Image J对条带的强度进行量化。GAPDH作为同型对照。

1.2.5 电 镜 实 验用M3814或/和VSVΔ51（0.001 PFU/个）处理Huh-7细胞24 h。室温下1 000 r/min离心5 min后收集细胞。然后将细胞颗粒重悬，用PBS洗涤1次，在1 500 r/min下离心5 min，并在含有2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）中冰上固定4 h。然后将样品进行标准透射电子显微镜超微结构分析。

1.2.6 体内实验本研究由深圳市第二人民医院动物伦理与福利委员会批准。对于皮下异种移植模型，将Huh-7（6×106个/只）细胞接种于4周龄雌性BALB/c-nu/nu小鼠的后侧皮下。6 d后，可触及的肿瘤形成后（50 mm3），小鼠随机分为4组。在6~8 d和12~14 d将VSVΔ51溶瘤病毒［2.5×107PFU/（kg·d）］尾静脉注射，M3814［2 mg/（kg·d）］腹腔注射共6次。每3 d测量肿瘤长度和宽度，按公式计算体积。体积=长×宽2/2实验结束后，剖出肿瘤组织拍照称重。

1.3 统计学分析所有实验数据采用SPSS19.0进行统计学处理。计量数据采用±s表示，组间样本比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同的小分子抑制剂与VSVΔ51联合对肿瘤细胞生长的抑制加入4种小分子抑制剂M3814、OSI-420、ZSTK474、SGX523。选 择 极 低 剂 量 的VSVΔ51 OV（0.01 PFU/个），确保单独的OV对肿瘤细胞的毒性很小。不同药物与VSVΔ51的组合与Huh-7共孵育后检测细胞存活。结果表明，随着小分子药物剂量的提升，M3814与VSVΔ51的组合与M3814单药比较对肿瘤细胞的杀伤能力显著提高，而VSVΔ51与其他药物的组合较单药并无明显的增效作用。结果表明M3814可以协同增强VSVΔ51的肿瘤杀伤能力。见图1。

图1 VSVΔ51与抗肿瘤药物联合对靶细胞的细胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of VSVΔ51 combined with anti-tumor drugs to target cells

2.2 敲低DNA-PK对溶瘤病毒抗肿瘤能力的影响实验表明DNA-PK抑制剂可以增强溶瘤病毒的肿瘤抑制能力，接下来探索了敲低Hun-7的DNAPK对溶瘤细胞抗肿瘤活性的影响。结果表明，设计的两种siRNA都能有效降低DNA-PKcs的表达。细胞存活实验表明，敲低DNA-PKcs可以有效增强VSVΔ51对肿瘤细胞的杀伤活性。见图2。这些结果表明，抑制DNA-PK的确可以增强VSVΔ51对肝癌细胞的杀伤活性。

图2 VSVΔ51对siRNA转染细胞的细胞毒作用Fig.2 Cytotoxicity of VSVΔ51 to siRNA transfected cells

2.3 M3814联合VSVΔ51增强肿瘤细胞内质网应激OV裂解肿瘤细胞的一个主要机制是通过内质网应激诱导的细胞凋亡。因此检测了M3814是否通过该途径增强抗肿瘤活性。将M3814与VSVΔ51单独或联合与Huh-7共孵育，通过电镜观察内质网肿胀程度来反映内质网应激状态。结果表明，M3814与VSVΔ51联 合 给 药 组 较M3814单 用 或VSVΔ51单用而言，内质网的肿胀程度都显著增强。结果表明，M3814与VSVΔ51联合给药可以显著增强Huh-7细胞的内质网应激状态。见图3。

图3 DNA-PK抑制增强内质网应激Fig.3 DNA-PK inhibition enhances ER stress

2.4 M3814联合VSVΔ51增强肿瘤抑制活性建立裸鼠皮下移植瘤模型来验证M3814联合VSVΔ51的体内抗肿瘤活性。通过检测治疗后肿瘤体积的变化，结果表明，M3814联合VSVΔ51治疗组可以显著抑制肿瘤的生长，而M3814或VSVΔ51单独给药组肿瘤抑制能力明显弱于联合治疗组。实验结束后观察肿瘤大小及称量瘤重，结果表明，联合治疗组的肿瘤质量明显低于单独给药组。以上实验说明，M3814联合VSVΔ51可以抑制体内肿瘤的生长。见图4。

图4 体内抗肿瘤作用Fig.4 Anti-tumor effects in vivo

2.5 M3814联合VSVΔ51增强肿瘤细胞凋亡收集治疗后的肿瘤组织，进行Western blot分析，结果表明，VSVΔ51治疗组中病毒蛋白E1含量明显升高，说明VSVΔ51可以在肿瘤部位聚集。此外，较其他组别而言，p-JNK及c-caspase 12蛋白表达水平在联合治疗组中表达量显著提高，说明肿瘤细胞的凋亡增加。结果说明，M3814联合VSVΔ51可以有效增强肿瘤细胞凋亡，从而更好地发挥VSVΔ51的抗肿瘤功能。见图5。

图5 肿瘤组织中凋亡相关蛋白的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of apoptosis-related proteins in tumor tissues

3 讨论

OV作为一种新型抗癌药物近年来发展迅速［13］。最著名的例子是美国食品和药品监督管理局（FDA）批准的用于治疗黑色素瘤的OV T-VEC［14］。然而，OV作为单一药物在患者中的治疗效果是有限的，因此有必要开发新的方案来最大限度地发挥OV治疗的潜力［15］。

VSVΔ51因其在肿瘤细胞中特异性复制、良好的体内稳定性和良好的人体安全性而成为一个极具吸引力的OV候选物。寻找与VSVΔ51协同作用的小分子可能是优化其肿瘤细胞杀伤的有效策略［16-17］。在这项研究中，通过基于不同信号通路的抗癌药物的筛选，发现DNA-PK抑制剂可以与VSVΔ 51发挥协同作用。通过抑制肿瘤细胞中DNA-PK的表达，发现肿瘤细胞对VSVΔ51的杀伤效果更加敏感，同时还探究了这种协同增效作用是因为DNAPK抑制剂加剧了VSVΔ51诱导的内质网应激，从而增强了肿瘤细胞的凋亡。体内实验中也证明这种联合疗法具有更强的肿瘤抑制能力。

靶向DNA-PK作为治疗人类恶性肿瘤的干预手段，特别是增强肿瘤细胞对化疗或放疗的敏感性，具有 临 床意义［18-20］。CC-122是 一 种DNA-PK抑制剂，处于Ⅰ期临床试验（NCT01421524），用于实体瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。CC-115是一种DNA-PK和mTOR的双重抑制剂，目前正处于治疗晚期实体瘤和血液恶性肿瘤的Ⅰ期试验（NCT-01353625）。目前正在进行结合放射治疗，DNA-PK抑制剂MSC2490484A治疗晚期实体肿瘤或慢性淋巴细胞白血病的Ⅰ期临床试验（NCT02516813和NCT02316197）。DNA-PK抑制剂VX-984联合化疗（NCT02644278）的安全性、耐受性和药代动力学/药效学研究已经完成。临床相关的DNA-PK抑制剂可能为OV的联合治疗提供很好的机会。

总体而言，研究表明，DNA-PK抑制剂与OV VSVΔ51联合治疗肝癌可以显著提高治疗效果，非常有希望在今后的临床上为肝癌的治疗提供新的方案。