不同绿僵菌菌株在玉米根际的定殖及对玉米生长的影响

廖兴刚，胡明瑜，孟泽彬，罗 倩，白文钦

(1.贵州师范学院 贵州省茶籽资源综合开发利用工程研究中心，贵州 贵阳 550018；2.重庆市农业科学院 生物技术研究中心，重庆 401329)

【研究意义】昆虫病原真菌是农业生态系统中多种害虫的寄生性天敌，其中已被广泛研究的绿僵菌(Metarhiziumspp.)和白僵菌(Beauveriaspp.)有着巨大的生物防治潜力，可应用于防治多种农、林业害虫[1]。近20年有关昆虫病原真菌致病机理的研究取得长足进步，通过生物工程技术遗传改良获得了高毒力致病菌株[2]。然而，由于昆虫病原真菌开发的真菌杀虫剂存在击倒害虫速度缓慢、防效不稳定，公众对转基因生物安全存在疑虑等因素，致使商业化真菌制剂产品并未得到大规模应用[3]。部分昆虫病原真菌如金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)与球孢白僵菌(Beauveriabassiana)具“两型性”生活史，即营寄生生活与营腐生生活[4]。长久以来人们主要关注昆虫病原真菌的侵染致病机理，即对营寄生生活进行了深入研究，而忽视了对营腐生生活的探究。对昆虫病原真菌不同生活史的片面研究导致对该类真菌认知的局限性。因此，只有了解昆虫病原真菌完整的生活史以及不同生活史转换的机制，才能更好、更充分的利用该类真菌进行生防制剂的开发应用。【前人研究进展】近几年来，金龟子绿僵菌与昆虫及植物宿主互作关系的相关研究已成为昆虫病原真菌开发应用研究领域的新方向。目前，已初步探明金龟子绿僵菌能定殖于植物根部[5]，利用植物根部分泌的蔗糖和棉籽糖等多糖类碳源物质营腐生生活[6-7]。在与宿主植物共生期间，金龟子绿僵菌可保护宿主植物，如杀死取食根部的害虫并转移氮素给植株以维系自身的养分来源[8]，或通过分泌植物发育必需的某些生长激素(如IAA)激活植物免疫系统，提高对病虫害的防御等途径促进宿主植物的生长[9]。在无化肥、农药施用的试验田，采用孢子包裹种子方式施用某些绿僵菌菌株能够促进小麦、玉米在田间的生长并提高其产量，证明绿僵菌具有作为生物肥料促进作物生长的潜在优势[10]。相关研究为开发兼具杀虫与植物生长增效作用的昆虫病原真菌制剂在农业生产实践中的应用提供了新方向。【本研究切入点】目前对绿僵菌营腐生生活机理虽有一定的研究，但对该类真菌在根际土壤中与宿主植物的互惠互作了解较少。从不同绿僵菌菌株在玉米根部定殖及对玉米生长的影响方面，探究不同来源(寄主、地域)的绿僵菌定殖植物根部的种间特异性，筛选能显著促进宿主植物生长的绿僵菌菌种的研究尚未见相关报道。【拟解决的关键问题】在已有研究基础上，以贵州省主要粮食作物玉米为材料，比较不同来源、种属的绿僵菌菌株在植株根部的定殖和促进植株生长能力，初步探明其营腐生生活阶段的种间特异性，旨在筛选能促进宿主玉米植株生长的优异菌株，为进一步开发兼具杀虫与植物生长增效于一体的新型真菌杀虫剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 真菌菌株 测试绿僵菌菌株均由美国马里兰大学昆虫系(Department of Entomology，University of Maryland，College Park)馈赠。菌株来源详见表1，所有菌株均经单孢分离，用PDA培养基在26 ℃培养14 d，备用。

表1 测试菌株信息

1.1.2 植物 玉米品种为黔单10号，是贵州省农业科学院旱粮研究所选育的适宜西南肥水条件较好区域种植的国审品种(国审玉20000015)，由贵州省农业科学院水稻研究所提供。

1.1.3 试剂 0.05% Tween 80，西宝生物(中国)；Gum Arabic阿拉伯胶，Sigma-Aldrich(USA)；Rose-bengal selective agar medium绿僵菌筛选培养基，Sigma-Aldrich(USA)。

1.1.4 仪器与设备 土陶盆(35 cm×40 cm)；SPAD 502 Plus叶绿素测定仪，Konica Minolta Sensing，Inc.(Japan)。

1.1.5 其他 玉米栽培用土取自重庆市农业科学院试验田，为西南山区丘陵地带常见黄壤土，经121 ℃灭菌处理后备用。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理 将绿僵菌孢子悬浮于体积分数为0.05%的Tween 80分散剂中，获得浓度为5×108个/mL的孢子悬浮液。在孢悬液中加入阿拉伯胶至终浓度为10%，使孢悬液趋于粘稠。

1.2.2 试验设计 根据菌株种类试验设10个处理(表1)，每种菌株处理8粒种子，即每处理8次重复。选取籽粒饱满健康的玉米种子，用微量移液器取20 μL孢子悬浮液滴至种子一面的胚乳表皮上，处理种子置于干燥通风处晾干3～5 h至孢子紧密粘附于玉米种子表面。采用同样方法处理玉米种子另一面，确保种子两面均吸附等量的真菌孢子。将各菌株孢悬液等比例混合经121 ℃灭菌后按同样方法处理种子作为对照(CK)。处理后的种子于第2天进行播种。

1.2.3 玉米播种与管理 采用盆栽种植玉米，于2016年7—8月在重庆市农业科学院试验基地进行。用土陶盆装入适量土壤，按每钵1粒进行播种，播种深度5 cm左右。盆栽玉米置室外生长1个月。植株生长期间不施肥，不施用任何杀虫剂和杀菌剂，定期浇水避免土壤板结。

1.2.4 真菌根部定殖测定 播种后1、2和4周，对照与每个真菌处理随机选取3株植株，使用芯型土壤取样器从离玉米主根1 cm附近钻取约0.5 g土壤，用0.05% Tween 80分散剂悬浮土样，充分振荡涡旋使土样中的真菌分散至溶液中。取100 μL土样悬浮液涂布于绿僵菌筛选培养平板，每个土样重复3个平板，于26 ℃培养10 d后计数平板上菌落数。计算每个土样中的菌落形成单位(cfu)，即得到每克根际土壤中的真菌数量(cfu/g)。

1.2.5 植株生长测定 课题组前期试验结果表明，罗伯茨绿僵菌(Mr23)与金龟子绿僵菌(Mr2575)对多种单、双子叶植物如小麦、玉米、花生及拟南芥的种子萌发均无影响。基于此，本研究取20颗经真菌处理的玉米种子播种于小型塑料盆钵中，5 d后测定种子的发芽率，4次重复。叶领形成计数法(Leaf Collar Method)是利用叶片分化生长情况确定玉米植株生长阶段的做法[11]，通过在特定时间(处理2周和4周)计数每株玉米叶领数量监测玉米叶龄的形成。处理1周、2周、3周和4周后定期测定植株茎秆高度作为植株茎秆生长指标。叶片叶绿素形成(含量)，处理1周、2周、3周和4周后采用手持式SPAD 502 Plus叶绿素测定仪测定新生叶片叶绿素含量，每株取靠近植株顶端两片叶片中部进行测量。

1.3 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 22进行数据统计、分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 不同绿僵菌菌株在玉米根际土壤中的定殖能力

根际土壤中真菌的种群数量可以反映其在植物根部的定殖能力。从图1看出，不同检测时期各测试绿僵菌菌株均能定殖于玉米根部，但不同种属绿僵菌菌株间的定殖能力存在差异；随着共生时间延长，各菌株在玉米根际土壤中的群体数量呈下降趋势；对照组在根际土壤中基本检测不到绿僵菌。不同检测时期(播种后1、2和4周)，菌株Mac324定殖玉米根部能力均显著低于其他菌株，根际群体数量始终最低。播种后第1周，各菌株在根际土壤中的群体数量为2166～4530 cfu/g，依次为Ma939>Mb2974>Mr2575>Ma932>Mr23>Ma808>Mb820>Mr1046>Mb1187>Mac324。其中，菌株Mb1187显著低于除菌株Mr1046外的其余处理。播种后第2周，各菌株在根际土壤中的种群数量为1384～3466 cfu/g，依次为Mr23>Mb820>Ma932>Ma939>Mr2575>Ma808>Mb2974>Mr1046>Mb1187>Mac324。其中，菌株Mb1187的定殖能力显著低于除Mr1046、Ma808和Mb2974外的其余菌株。播种后第4周，各菌株在根际土壤中的种群数量为686～2595 cfu/g，依次为Ma932>Mr2575>Ma808>Mr1046>Mb820>Mr23>Ma939>Mb2974>Mb1187>Mac324。其中，菌株Mb1187的定殖能力显著低于Ma932和Mr2575，与其余菌株差异不显著。

不同种属绿僵菌菌株间，如M.acridum(Mac324)菌株与M.anisopliae(Ma808、Ma932和Ma939)、M.brunneum(Mb820、Mb1187和Mb2974)及M.robertsii(Mr2575、Mr23和Mr1046)菌株间种群数量存在显著差异；同一种属菌株如Mb1187与Mb820、Mb2974间的种群数量也存在一定差异。

2.2 不同绿僵菌菌株对玉米生长的增效效应

2.2.1 玉米种子的萌发率 某些根系微生物能促进宿主种子的萌发。从图2看出，各菌株处理玉米种子的萌发率为92.5%～96.3%，依次为Mr1046=Ma939=Mb820>Mr23=Ma808=Ma932=Mac324>Mr2575=Mb1187>Mb2974，但均与CK差异不显著，说明绿僵菌对玉米种子的萌发没有促进作用。推测绿僵菌只有在根部定殖后才能与宿主植株形成互惠共生关系。

2.2.2 玉米的营养生长 从图3看出，不同生长时期绿僵菌对玉米叶片和茎秆生长的影响。

(1)叶片。在玉米播种后第2周，各处理玉米叶领数为2.1～3.0片，依次为Mb820=Mr2575(3.0片)>Ma939=Mr23=Ma808(2.9片)>Mb2974=Ma932=Mr1046(2.8片)>Mb1187(2.6片)>Mac324(2.1片)，较CK(2.1片)提高0%～42.8%，除菌株Mac324外其余菌株对玉米叶片生长均有促进作用，但菌株处理间的增效无显著差异；播种后第4周，玉米叶领数为5.6～6.6片，依次为Mb820=Ma939=Mr23=Mr2575=Mb2974(6.6片)>Ma808(6.5片)>Ma932(6.4片)>Mr1046(6.3片)>Mb1187(6.1片)>Mac324(5.6片)，较CK(5.6片)提高0%～17.8%。其中，菌株Mb1187、Mac324的玉米叶片生长与CK差异不显著，其余处理均显著高于对照，菌株处理间的增效同样无显著差异。

(2)茎秆。在玉米幼苗生长初期(播种后第1～2周)，所有菌株对玉米幼苗茎秆生长无影响。第1周，各处理玉米茎秆高度为2.9～3.2 cm；第2周，玉米茎秆高度为19.1～21.1 cm；所有菌株处理与CK无显著差异。在幼苗生长中期(播种后第3周)，玉米茎秆高度为39.5～46.5 cm，依次为Mr23(46.5 cm)>Mr2575(45.4 cm)>Mb2974(45.1 cm)>Mb820(44.5 cm)>Ma932(44.2 cm)>Ma808(43.9 cm)>Ma939(43.2 cm)>Mr1046(42.1 cm)>Mb1187(40.0 cm)>Mac324(39.5 cm)，其中，菌株Mb1187与Mac324对幼苗茎秆生长基本无影响，较CK(40.3 cm)下降0.74%～2.0%，与CK差异不显著；其余菌株较CK提高4.47%～15.4%，均显著促进幼苗茎秆生长。至幼苗生长后期(播种后第4周)，各处理玉米茎秆高度为67.1～78.2 cm，依次为Mr23(78.2 cm)>Ma932(75.1 cm)>Mb2974(74.9 cm)>Ma939(74.7 cm)>Mr2575(74.2 cm)>Mb1187(73.4 cm)>Mb820(73.0 cm)>Ma808(72.5 cm)>Mr1046(68.4 cm)>Mac324(67.1 cm)，Mac324较CK(67.6 cm)下降0.74%，其余处理较CK提高1.18%～15.70%。其中，菌株Mr1046与Mac324处理的玉米幼苗茎秆生长均与CK差异不显著，其余菌株均显著促进幼苗茎秆生长。

2.2.3 玉米叶片的叶绿素含量 叶片叶绿素形成对植物光合作用至关重要，影响光合作用第一阶段也就是光反应阶段。植物的叶绿素含量与光合速率成正相关，光合作用强的植株最终产出的生物量增多。因此，检测真菌处理的玉米叶片中的叶绿素形成有助于了解绿僵菌是否通过促进玉米的叶绿素合成提高宿主植株的生物量产出。从图4看出，播种后第1周，各处理玉米叶片的叶绿素含量为34.39～36.94 SPAD，CK为34.73 SPAD；播种后第2周，叶绿素含量为40.25～43.37 SPAD，CK为40.86 SPAD；播种后第3周，叶绿素含量为48.95～52.24 SPAD，CK为48.62 SPAD；播种后第4周，叶绿素含量为52.00～54.44 SPAD，CK为52.46 SPAD。表明，随着生长期的延长，各处理玉米叶片叶绿素含量均呈上升趋势，但在玉米不同生长时期(1～4周)各处理玉米叶片叶绿素含量与当期CK均无显著差异。说明，绿僵菌定殖玉米根部不影响宿主植物的叶绿素合成。

3 讨 论

供试菌株除Mr2575、Mr23、Ma939与Mb820外，其余菌株尚未见能定殖于植物根部的研究报道。该研究所有测试菌株均能定殖于玉米根部，但菌株Mac324与Mb1187的定殖能力较弱，暗示了绿僵菌属真菌在植物根部营腐生生活的普遍性。M.acridum种是一类专化性极强的绿僵菌菌株，主要侵染寄生蝗虫。在土壤中很少分离得到专化性强的昆虫病原真菌，包括绿僵菌与白僵菌菌株。因此，推测专化性强的菌株很难在土壤中存活[12]。该研究结果也证实了菌株Mac324的根部定殖能力显著低于其他菌株，推测随着释放真菌在土壤中循环周期的延长，其最终可能在植物根部甚至土壤中消失。M.brunneum种绿僵菌在土壤中存在较多，但研究发现，菌株Mb1187的根部定殖能力较弱，可能与该类绿僵菌在土壤中偏好性地与草类互惠共生有关[13]；但其余2株M.brunneum菌株Mb820与Mb2974却能很好地定殖于玉米根部，推测即使在同一种属内的菌株也可能具有不同的植物宿主偏好性。除个别菌株外，大部分供试菌株定殖植物根部能力与其促宿主植株生长呈正相关。与之前的研究报道[10]相一致，说明根部是昆虫病原真菌与宿主植物发生互作非常重要的一个界面。对于具有促进宿主植物生长能力的菌株而言，在根部定殖的菌群数量可能决定了该共生真菌对宿主的作用效果。

玉米的营养生长主要集中在苗期阶段，视品种不同该阶段生长周期为20～35 d。该阶段是决定玉米能否高产的关键时期，苗壮、苗齐是大田丰收的基础。玉米幼苗在3片叶以前所需养分由种子自身供给，从第4片叶开始，植株利用的养分才从土壤中吸收[14]。在同一生境中，无外源肥料供给情况下，幼苗生长差异与释放在根部的真菌密切相关。因此，研究重点监测了幼苗阶段的主要生长指标叶领数形成与茎秆生长，以比较不同菌株处理后的玉米营养生长情况。菌株Mr1046对玉米幼苗生长后期茎秆生长的增效不显著，但其根部定殖能力在此时期仍然显著高于同样对玉米茎秆生长无促进作用的菌株Mac324，原因可能与该菌株在玉米幼苗生长后期定殖根部的减少有一定关联，但此关联仍需进一步研究证实。

4 结 论

研究选用绿僵菌菌株主要来源于国外不同国家与地域，均收集于美国农业部昆虫病原真菌菌种保存中心(USDA-ARSEF Collection，Ithaca，USA)。各菌株来源、宿主昆虫及遗传背景较清晰，对绿僵菌营腐生生活阶段的种间特异性具有一定的参考价值。研究结果表明，菌株Mr23、Ma939和Mb820定殖玉米根部与促进玉米植株生长的能力较优，可作为候选菌株进一步进行毒力测试从而筛选出具有良好杀虫与植物生长增效于一体的绿僵菌生防菌株。