干旱胁迫下不同枯草芽孢杆菌对玉米萌发的影响

刘晓霞， 李 安， 舒健虹， 罗 维， 王小利

(1.贵州省农业科学院草业研究所， 贵阳 550006；2.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院，山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室，山地生态与农业生物工程协同创新中心， 贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院， 贵阳 550025)

玉米作为世界上主要的粮食和饲料作物之一，近年来在我国的播种面积不断加大，成为我国农业生产重要组成部分。玉米对水分敏感，水分已成为制约玉米生产的最重要生态因子之一。玉米种子萌发和出苗困难是制约其在干旱地区生产的关键环节[1]。张飞等[2]研究表明，对于多数作物而言，芽、苗期都是对干旱胁迫反应敏感的关键时期，干旱会造成作物种子出苗困难、幼苗根系、叶片等形态学特征发生变化，出现叶面积下降、株高变矮现象，使玉米的抗旱性能增强，造成玉米产量降低。因此，作物抗旱性研究日趋重要。依靠植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)提升作物抗旱性的研究已有报道，赵慧云等[3]进行植物根围促生菌诱导小麦幼苗耐旱性的研究结果表明，四种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)处理组的抗旱系数都显著高于对照，根围促生菌能诱导小麦苗期的耐旱性。而枯草芽孢杆菌更多的应用于植物生物病害防治，依据其生理特征丰富多样，极易分离培养,能产生多种抗菌素和酶。枯草芽孢杆菌应用于植物病害生物防治的研究已经有很多年的历史[4],目前在黄瓜[5-6]、辣椒[7-8]、水稻[9-10]、小麦[11-13]、玉米[14-16]等农作物病害上表现出较好的防治效果。玉米与小麦同为禾本科一年生植物，所以枯草芽孢杆菌可提高小麦耐旱性，具有依靠植物根际促生菌提升玉米抗旱性提供可行性方向与研究的意义。

1 实验材料与方法

供试玉米品种为金玉818，由贵州省农业科学院旱粮所提供。菌种由贵州省野外采集实验室保存及生物商品菌肥筛选(表1)。

1.1 菌种制备

1.1.1将菌种培养扩试验方法

将所测菌种(表1)扩增，调节OD600值至0.9左右备用。

表1 试验菌种来源及编号

1.1.2种子预处理

将选取籽粒饱满、大小均匀的玉米种子于10%次氯酸钠溶液下消毒20 min，再用无菌水洗涤3～5遍，自然晾干备用。

1.1.3试验处理

选择15%浓度过滤除菌的PEG溶液来模拟干旱条件，以准备好的菌种将消毒的玉米种子置于20 mL菌液中浸泡4 h，捞出玉米种子，自然风干后置于装有两层滤纸且灭菌后的培养皿中，倒入20 mL 15%浓度过滤除菌的PEG溶液(ck,无菌水)，每个处理3个重复，每个重复45粒种子，于(25±1)℃恒温光照培养箱内培养。记录种子起始萌发的时间,每日记录发芽情况，直至不再发芽为止。

测量指标及方法：自播种起每日记录起发芽数以及发霉数，待不再发芽时相互比较芽长及根长，并称量其鲜重后放置于烘箱105 ℃烘烤1 d，而后称量干重。计数发芽指数及活力指数。

发芽指数=∑(Gt/Dt)，其中：Gt为t天时种子萌

发的数量，Dt为播种后天数；

活力指数=发芽指数×鲜重；

幼苗含水量=[(SL-G)/SL]×100%,其中：SL为幼苗鲜重，G为幼苗干重。

1.2 数据统计及分析

试验数据采用Excel 2016软件进行统计分析，方差分析采用SPSS软件分析

利用如下公式分别计算单项指标抗旱系数、综合抗旱系数、抗旱指数、隶属函数值、抗旱性量度值

单项指标耐旱系数(PI)=不同浓度处理下的平均测定值/对照测定值

(1)

综合抗旱系数

(2)

抗旱指数

(3)

隶属函数值

(4)

(5)

标准差系数

(6)

权重系数

(7)

抗旱性量度值

(8)

式中，Xij和Xj分别表示第i处理第j个指标的隶属值和所有株系第j个指标的平均值;Xmin和Xmax表示第j个指标的最小值和最大值;m与n分别表示指标的个数和处理数;计算隶属函数值时，若指标与耐旱性呈正相关用公式(4)，若指标与耐旱性呈负相关用公式(5)。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下不同枯草芽孢杆菌对玉米萌发的发芽指数、活力指数、幼苗含水量的影响

由表2所示，不同菌种对玉米发芽指数、活力指数、幼苗含水量的影响不同，玉米发芽指数在R 60处理显著(p<0.05)高于ck，而R 286-5处理显著低于ck(p<0.05)，其余菌种处理均与ck无明显差异。不同菌种对玉米活力指数影响中，R 9、R 60处理下玉米的发芽活力指数均显著(p<0.05)高于ck，其余各处理均与ck无明显差异，且R 9显著高于其余各处理下玉米发芽的活力指数，除R 9外，R 60均显著高于其他处理下玉米发芽的活力指数。在幼苗含水量方面，除R 286-5处理显著低于ck，其余各处理组与ck无明显差异。综上所述，R 60有利于提高玉米发芽过程的发芽势活力指数的增长，R 9有利于提高玉米发芽过程的活力指数的增长，而R 286-5对于玉米发芽过程的发芽势以及幼苗含水量有显著的抑制作用，其余各处理对于干旱胁迫下对玉米萌发过程的发芽指数、活力指数、幼苗含水量无显著影响。

表2 不同菌种处理对玉米发芽指数、活力指数、幼苗含水量的影响

2.2 不同菌种在干旱胁迫下对玉米萌发相关生长指标的影响

如表3所示，发芽3 d后的发芽率在R 29-1处理处最高，但是与ck差异不显著(p>0.05)，R 40-1、CJ-3、R 286-5、R 60处理均显著低于ck。发芽6 d后CJ-2、R 286-5、CJ-3、R 10、R 40-2等菌种的发芽率均显著(p<0.05)低于R 24-2、R 60、R 40-2、R 29-1、R 59，R 24-2、R 60、R 40-2、R 29-1、R 59，与ck差异不显著，且R 40-1、R 286-5均显著低于ck。发芽9 d后的发芽率除R 286-5显著低于R 24-2、R 60、R 29-2、R 40-2、R 29-1、R 19-2、R 9、R 59，其余各个处理间差异不显著。在芽长方面，R 60、CJ-4、R 59、R 9、CJ-1、CJ-3、R 40-1、R 29-1均显著(p<0.05)高于ck，此几组处理间差异不显著，而其余各组处理与ck间差异均不显著。在根长上，R 286-5、R10两种菌种处理下玉米发芽期的根长显著(p<0.05)低于R 59、R 40-1、CJ-2处理，但与ck差异不显著，其余处理间差异不显著。对于根数来说，R 24-2、R 60、CJ-1、CJ-2、CJ-3、CJ-4等菌种处理下，玉米发芽过程中的根数显著高于ck，而R 29-2、R 10两种菌种处理显著低于ck。不同菌种处理下对玉米发芽结束后鲜重的影响不同，表3所示，CJ-1、CJ-3、CJ-4、R 286-5、R 10、R 40-2处理下玉米发芽结束后的鲜重显著低于ck，而R 59、R 9、R 40-1等处理下玉米发芽结束后的鲜重显著高于ck，其余各处理与ck之间差异不显著。CJ-1、CJ-3、CJ-4处理下玉米发芽结束后的干重显著低于ck，R 9处理下玉米发芽结束后的干重显著高于ck，其余各处理与ck之间差异不显著。整体来说，不同菌种的处理下对于玉米发芽过程的生长指标存在不同影响，明确影响关系，需要进行更加复杂的运算。

表3 不同菌种处理对玉米相关生长指标的影响

2.3 干旱胁迫下不同菌种处理下的玉米抗旱性

运用模糊数学隶属函数公式对各指标进行标准化处理，并且利用标准差系数赋予权重法对各指标赋予权重从而定量地比较株系间的抗旱能力。根据公式(3)～公式(8)计算相应的隶属函数值，抗旱性量度值，综合抗旱指数;根据抗旱指数与权重计算加权抗旱指数。如表4、表5所示，干旱胁迫下不同菌种处理的玉米抗旱性影响不同，综合指标抗旱系数并不一致，其中以R 60、R 40-2、R 29-1、R 9、R 19-2、R 59等菌种处理下玉米种子都有较高的综合指标抗旱系数，其中R 9菌种处理下玉米种子有最高的综合指标抗旱系数，R 286-5和R 9菌种处理下玉米种子都有最低的综合指标抗旱系数，表明R 9菌种处理下玉米种子有最高抗旱性，而R 286-5和R 9菌种处理下玉米种子不利于种子对抗干旱的环境。抗旱性量度值代表了不同菌种处理下植株株系的抗旱性，以其对各株系进行抗旱性排序，结果可知各不同菌种处理下植株抗旱性为：R 9>R 60>R 29-1>R 59>R 40-2>R 19-2>R 24-2>CJ-2>R 29-2>R 40-1>ck>CJ-1>R 10>CJ-4>CJ-3>R 286-5。就抗旱性量度值是否能够客观地表达出不同菌种处理下植株株系的抗旱性需要与其他数据进行相关性分析。如表6所示，除根长、芽长、根数以外，抗旱性量度值与其他指标的相关性均达到显著水平，且呈正相关。抗旱性量度值既要考虑各指标的重要性，又要考虑各指标间的相互关系。因此，用抗旱性量度值综合评价抗旱性是否较为全面和准确反映各株系的抗旱性，需要对各项指标进行主成分分析，筛选出较为合理指标进行分析。

表4 不同菌种对玉米萌发指标的抗旱系数

表5 不同菌种对玉米萌发指标的抗旱性综合评价

表6 各指标隶属函数值相关性与抗旱性量度值相关性分析

3 讨论与结论

发芽率、发芽势和种子活力指数反映植物种子发芽速度、发芽整齐度和幼苗健壮的趋势,常作为评价种子发芽的指标[17]，不同菌种处理下对玉米萌发的发芽率、发芽势和种子活力指数影响程度不一样，其中R 60有利于提高玉米发芽过程的发芽势活力指数的增长，R 9有利于提高玉米发芽过程的活力指数的增长，而R 286-5对于玉米发芽过程的发芽势以及幼苗含水量有显著的抑制作用，说明R 60、R 9两种菌种可以提高玉米种子萌发过程中的干旱耐受性，R 286-5不利于提高玉米种子萌发过程中的干旱耐受性。但是单方面的指标评断结果不具有说明性，本试验中不同菌种处理下玉米的芽长、根长、根数、鲜重、干重影响不同，运用模糊数学隶属函数公式对各指标进行标准化处理，并且利用标准差系数赋予权重法对各指标赋予权重从而定量地比较株系间的抗旱能力，该种评价方式用于多指标进行的整体评价，消除了单一指标带来的片面性，同时进行相关性分析、隶属函数和标准差系数赋予权重法的方法将所测指标进行分析，结果可知，不同菌种处理下植株抗旱性为：R 9>R 60>R 29-1>R 59>R 40-2>R 19-2>R 24-2>CJ-2>R 29-2>R 40-1>ck>CJ-1>R 10>CJ-4>CJ-3>R 286-5。李丽霞等[18]在转AtNHX1基因马铃薯田间盐胁迫下的生理反应及耐盐性的综合评价采用该种综合评价方式，最终以耐盐性量度值D的大小来衡量耐盐性的高低，本试验同样采用该种方式，并进行抗旱性量度值与指标间的相关性分析，发现除根长、芽长、根数以外，抗旱性量度值与其他指标的相关性均达到显著水平，且呈现正相关关系。所以能够确定抗旱性量度值既要考虑各指标的重要性，又要考虑各指标间的相互关系。因此，用抗旱性量度值综合评价抗旱性较为全面和准确。