基于网络药理学探讨知柏地黄汤治疗前列腺癌的作用机制

房立源 李慧杰 王志鹏 李秀荣

摘要：目的  基于网络药理学探讨知柏地黄汤治疗前列腺癌的作用机制。方法  利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和UniProt数据库获取知柏地黄汤有效成分及作用靶点，通过OMIM和CTD数据库筛选前列腺癌的相关靶点，将有效成分靶点与疾病靶点取交集，运用Cytoscape 3.7.1软件构建药物-有效成分-靶点-疾病网络，运用String数据库绘制交集靶点的蛋白相互作用（PPI）网络，经拓扑分析找出关键靶点，并进行GO和KEGG富集分析，运用分子对接技术对主要有效成分与关键靶点进行分子对接。结果  共获得知柏地黄汤有效成分107个，作用于150个靶点，前列腺癌靶点825个，知柏地黄汤和前列腺癌交集靶点65个，主要有效成分有谷甾醇、槲皮素和山柰酚，关键靶点包括JUN、TP53、MAPK1、TNF和MAPK14。GO功能富集得到1668个条目，包括生物过程1527个、分子功能102个、细胞组分39个，KEGG通路富集得到134条通路，主要涉及癌症途径和PI3K-Akt信号通路等。分子对接结果显示，化合物和靶点之间具有较好的结合性。结论  知柏地黄汤治疗前列腺癌具有多成分、多靶点、多通路的特点，可为进一步研究提供理论基础。

关键词：网络药理学;分子对接;知柏地黄汤;前列腺癌;作用机制

中图分类号：R273;R285.5    文献标识码：A    文章编号：2095-5707（2021）05-0006-07

DOI： 10.3969/j.issn.2095-5707.2021.05.002        開放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Exploring the Mechanism of Zhibai Dihuang Decoction in Treating Prostate Cancer Based on Network Pharmacology

FANG Li-yuan¹， LI Hui-jie²， WANG Zhi-peng²， LI Xiu-rong^2*

（1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China; 2. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China）

Abstract： Objective To explore the material basis and mechanism of Zhibai Dihuang Decoction in the treatment of prostate cancer based on network pharmacology. Methods TCMSP database and UniProt database were used to screen out the active components and target genes of Zhibai Dihuang Decoction. The target genes of prostate cancer were screened out through OMIM and CTD databases. Cytoscape 3.7.1 software was used to construct the TCM component-target network; String database was used to construct the protein interaction （PPI） network diagram of Zhibai Dihuang Decoction to treat prostate cancer， and it was found the core target through topological analysis. The R database was used for GO analysis and KEGG analysis. Finally， the core active components were docked with the key targets through molecular docking technology. Results There were 107 active components， 150 gene targets， and 825 prostate cancer disease targets in Zhibai Dihuang Decoction， and 65 intersection targets in Zhibai Dihuang Decoction and prostate cancer. The more effective components were： sitosterol， quercetin and kaempferol， and the key core targets were： JUN， TP53， MAPK1， TNF and MAPK14. GO biological process and KEGG enrichment analysis showed that there were 1668 GO pathways and 134 KEGG pathways involved in cancer pathway and PI3K-Akt signaling pathway. Molecular docking results showed that the core components had good binding energy with the key targets. Conclusion Zhibai Dihuang Decoction has the characteristics of multi-component， multi-target and multi-pathway in the treatment of prostate cancer， which provides a theoretical basis for further studies.

Key words： network pharmacology; molecular docking; Zhibai Dihuang Decoction; prostate cancer; mechanism

前列腺癌是老年男性常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，2018年全球前列腺癌新发患者约127万，位居新发肿瘤第3位，死亡人数约36万^[1]。根据我国癌症中心发布的数据显示，2015年我国新发前列腺癌患者7.2万人，位居男性肿瘤新发人数第6位，且新发患者中70%是中晚期，五年生存率为66.4%。美国及欧洲各国新发前列腺癌患者81%处于早期，且五年生存率为99.5%^[2]。前列腺癌早期临床表现无特异性，多为尿频、尿急、排尿中断、尿痛、血尿等，中晚期则以下尿路梗阻、转移性骨痛、脊髓压迫神经症状和病理性骨折等表现为主^[3]。

前列腺癌属中医学“淋证”“癃闭”等范畴，病位在肾与膀胱，病机主要为肝肾阴虚，膀胱湿热，《诸病源候论·诸淋病候》曰：“诸淋者，由肾虚膀胱热故也。”中医通过辨病与辨证相结合，把握前列腺癌的病机特点，灵活处方用药，随症加减，在提高患者生存质量、减轻不良反应方面显示出确切疗效。张亚强认为前列腺癌的病机为本虚邪盛，本虚为气血亏虚、脾肾两虚，邪盛为热、毒、瘀、湿、痰互结，且多为虚实夹杂^[4]。郭军认为肾气亏虚是本病发生的根本原因，因虚致实^[5]。如《黄帝内经》所言：“邪之所湊，其气必虚。”知柏地黄汤出自清代医家吴谦所著《医宗金鉴》，以六味地黄丸为基础方，合知母、黄柏而成，具有滋阴降火功效，是治疗阴虚火旺的代表方，主治阴虚火旺而致骨蒸劳热、虚烦盗汗、腰脊酸痛、遗精等证。王晔等^[6]运用知柏地黄汤联合化疗治疗肾阴虚型前列腺癌患者80例，结果显示，联合治疗组患者临床症状显著改善，精子质量提高。刘华等^[7]运用知柏地黄汤加减联合内分泌治疗晚期前列腺癌患者，经过3个月治疗后，联合治疗组患者潮热不适等不良感觉明显改善。近年来，网络药理学的兴起和发展为中药现代化研究提供了新思路，本研究运用网络药理学方法，深入探讨知柏地黄汤治疗前列腺癌的潜在作用机制，为进一步研究知柏地黄汤治疗前列腺癌的药理机制提供依据，并为临床应用提供参考。

1  研究方法

1.1  知柏地黄汤有效成分和作用靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/uniprot/）获取知柏地黄汤有效成分和作用靶点，设置筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18。

1.2  前列腺癌相关靶点获取

以关键词“Prostate Cancer”在OMIM（https：// www.omim.org/）、CTD（https：//ctdbase.org/）数据库检索前列腺癌相关靶点，并通过查阅文献进行补充，最后导入UniProt数据库进行靶点名称标准化处理，利用Venny 2.1在线工具筛选知柏地黄汤有效成分和前列腺癌的交集靶点，并绘制韦恩图。

1.3  药物-有效成分-靶点-疾病网络构建

将知柏地黄汤组成药物、有效成分、交集靶点导入Cytoscape 3.7.1软件，构建药物-有效成分-靶点-疾病网络。网络中的节点表示药物、有效成分、交集靶点及疾病，连线表示节点间的相互作用。

1.4  蛋白相互作用网络构建

将交集靶点导入String数据库（https：//string-db.org/），选择物种为“homo sapiens”（人源），最低相互作用阈值设为“highest confidence=0.9”，得到蛋白相互作用（PPI）网络。

1.5  知柏地黄汤治疗前列腺癌关键靶点筛选

应用Cytoscape 3.7.1软件对PPI网络进行拓扑分析，计算PPI网络整体的中介中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）和点度中心性（Degree Centrality，DC），选取BC、CC和DC均大于平均值的靶点为关键靶点，明确PPI网络中的关键靶点。

1.6  交集靶点富集分析

通过R语言将交集靶点转换为entrez ID，并运行BiocManager、clusterProfiler等程序包进行数据处理，以P<0.05为条件获得GO功能和KEGG通路富集分析气泡图。最后运用Perl语言将entrez ID转换为原始基因靶点。根据功能分析和通路富集结果对知柏地黄汤治疗前列腺癌的作用机制进行预测。

1.7  主要有效成分与核心靶点的分子对接

选取知柏地黄汤中5个主要有效成分（豆甾醇、槲皮素、山柰酚、异谷葵碱和β-谷甾醇）与3个关键靶点（TP53、ESR1和JUN）进行分子对接。从PDB数据库（https：//www.rcsb.org）中下载靶点蛋白的3D结构，从TCMSP数据库中下载有效成分的3D结构并保存为mol2格式。利用PYMOL软件对靶点蛋白进行除水除配体，利用AutoDock 1.5.6软件将有效成分及靶点蛋白的格式转换为pdbqt格式，最后运行AutoDock Vina进行分子对接，使用PYMOL软件对结果进行可视化。一般认为，有效成分和靶点的结合自由能<-5 kcal/mol表示具有较好的结合性。

2  结果

2.1  有效成分-疾病靶点筛选

筛选得到知柏地黄汤有效成分107个，作用靶点150个，前列腺癌靶点825个，知柏地黄汤作用靶点和前列腺癌交集靶点65个，韦恩图见图1。

2.2  药物-有效成分-靶点-疾病网络

采用Cytoscape 3.7.1软件构建药物-有效成分-靶点-疾病网络，见图2。该网络中共有157个节点，包括作用于交集靶点的有效成分83个，靶点65个，760条相互作用连线。对知柏地黄汤有效成分进一步分析，结果提示，知柏地黄汤治疗前列腺癌的有效成分主要为生物碱类和甾醇类，其中度值排名前5位的有效成分为豆甾醇、槲皮素、山柰酚、异谷葵碱和β-谷甾醇。运用Cytoscape 3.7.1软件对活性成分进一步分析，度值≥26的21个有效成分见表1。

2.3  PPI网络

为研究各靶点的相互作用关系，将65个交集靶点进行PPI网络分析。结果显示52个靶点发生较强的相互作用，共产生148条相互作用连线，见图3。

2.4  关键靶点网络

PPI网络DC平均值为4.5，BC平均值为0.007，CC平均值为0.405，选取BC、CC、DC均大于平均值的靶点为关键靶点，共有关键靶点19个，关键靶点PPI网络见图4。主要包括JUN（转录因子AP-1）、TP53（肿瘤蛋白p53）、MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）、TNF（肿瘤坏死因子）、MAPK14（丝裂原活化蛋白激酶14）、ESR1（雌激素受体1）、EGFR（表皮生长因子受体）等。

2.5  GO功能富集分析

对65个交集靶点进行GO功能富集分析，包括分子功能（MF）、生物过程（BP）及细胞组分（CC）。共获得1668条GO功能富集条目（P<0.05），其中BP条目最多，共有1527个，主要集中在细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、对活性氧的反应（response to reactive oxygen species）、对氧化应激的反应（response to oxidative stress）和细胞对氧化应激的反应（cellular response to oxidative stress）。MF相关条目有102个，主要涉及血红素结合（heme binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）和蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）。CC相关条目有39个，主要涉及囊泡腔（vesicle lumen）、细胞膜筏（membrane raft）和细胞膜微区（membrane microdomain）等。见图5～图7。

2.6  KEGG通路富集分析

對65个交集靶点进行KEGG通路富集分析，共获得134条通路（P<0.05）。主要涉及流体剪切应力和动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、前列腺癌（prostate cancer）等通路。见图8。

2.7  分子对接结果

知柏地黄汤主要有效成分与关键靶点的对接结果见表2，具体示意图见图9。结果表明，豆甾醇、槲皮素、山柰酚、异谷葵碱和β-谷甾醇与关键靶点TP53、ESR1、JUN具有较好的结合性。

3  讨论

本研究应用网络药理学方法对知柏地黄汤治疗前列腺癌的作用机制进行初步研究，系统揭示了知柏地黄汤治疗前列腺癌的物质基础和分子机制。其中豆甾醇、槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇在网络中的度值较大，可能是治疗前列腺癌的主要有效成分。研究发现，上述成分可抑制多种癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，如肝癌细胞^[8-9]、胃癌细胞^[10-11]、前列腺癌细胞^[12]、结肠癌细胞^[13]、肺癌细胞^[14]、胶质瘤细胞^[15]及乳腺癌细胞^[16]等。

对知柏地黄汤与前列腺癌的交集靶点进行PPI映射，并构建关键靶点PPI网络，关键靶点主要有JUN、TP53、MAPK1、TNF等，可能是知柏地黄汤治疗前列腺癌的潜在靶点。TP53基因位于人类第17号染色体上，研究表明，超过50%的肿瘤患者存在TP53基因突变，肿瘤相关的突变型p53蛋白不仅失去抑制肿瘤的功能，并且在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、耐药性等方面发挥重要作用^[17]。张帅等^[18]研究发现，TP53高表达可能预示着原发性胃间质瘤患者术后具有更高的复发和转移风险。费喜佳^[19]实验表明，β-谷甾醇可调节TP53基因，加速肿瘤细胞凋亡。卞春安等^[20]分析了120例肺腺癌患者术后病理资料，并运用免疫组化法检测患者组织标本中突变型p53蛋白的表达。结果显示，TP53基因突变的肺腺癌患者预后较差，突变型p53蛋白可以作为预测患者预后的分子标志物。MAPK是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于哺乳动物细胞质和细胞核内，能将细胞外刺激信号传导至细胞内及细胞核内，并引起细胞生物学行为，具有调节细胞增殖、分化、发育和凋亡的功能^[21]。MAPK通路的异常活化会导致细胞丧失分化和凋亡能力，引起细胞异常增殖、恶性转化，在肿瘤耐药的机制中发挥重要作用^[22-23]。车焕莉^[24]研究表明，疏肝益肾方能下调人表皮生长因子受体2基因表达，抑制MAPK通路，起到逆转乳腺癌细胞耐药的作用。小檗碱可通过调节活性氧相关信号通路JNK/p38 MAPK、蛋白激酶C和细胞外信号调节激酶（ERK）等，激活内源性线粒体凋亡通路，发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用^[25]。李倩等^[26]研究表明，红景天苷可延缓人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长速度，破坏肿瘤细胞结构，促进肿瘤细胞凋亡，其机制可能与抑制MAPK/ERK1/2信号通路有关。在本研究中，知柏地黄汤可能通过MAPK的3种亚型MAPK1、MAPK8和MAPK14发挥抑制前列腺癌的作用。

现有研究显示，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达^[27]，在结肠癌中EGFR的高表达影响结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，EGFR可作为肿瘤早期诊断和预后的重要指标^[28-29]。蒋寒冰等^[30]研究发现，黄芩素可通过抑制癌症相关的EGFR-STAT信号通路，靶向作用于TGF-β₁，逆转胃癌上皮间质转化。JUN在多种癌症中差异表达且具有较强活性，在乳腺癌中活化的JUN可影响肿瘤血管的生长，促进乳腺癌的转移^[31];在膀胱癌患者中，JUN低表达患者的预后远优于高表达患者^[32]。雌激素受体主要有2个亚型，分别为雌激素受体α（ESR-α/ESR1）和雌激素受体β（ESR-β/ESR2）。研究发现ESR1与山柰酚相结合具有很好的抗肿瘤作用^[33]。TNF是肿瘤微环境中最重要的炎性细胞因子之一，其中以TNF-α最具代表性，主要介导炎症反应。β-谷甾醇可抑制TNF-α的生成，减轻炎症反应，改善肿瘤微环境，促进肿瘤细胞凋亡^[34]。

综上所述，知柏地黄汤可能通过作用于JUN、TP53、MAPK1等靶点发挥治疗前列腺癌的作用。本研究尚存在不足之处，检索的数据库不能完全包括知柏地黄汤所有的化学成分及其相应的靶点，计算化学生物学方法本身也具有一定的局限性，且预测结果还有待后期的实验加以验证。

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（收稿日期：2021-04-12）

（修回日期：2021-05-08;编辑：郑宏）