牡丹生殖生物学的研究进展

张镇梁，邢福武，侯小改，王发国，乔 琦*

（1.河南科技大学农学院/牡丹学院，河南洛阳471023；2.中国科学院华南植物园，广东广州510650）

牡丹（Paeonia suffruticasaAndrews.）是芍药科（Paeoniaeeae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Sect.Mou⁃tonDC）植物，为多年生灌木［1-3］。该组分为两个亚组：革质花盘亚组（Subsetc.Vaginatea）和肉质花盘亚组（Subsetc Delavayanae Stern），共9 个种。其中，革质花盘亚组包括矮牡丹（Paeonia jishanensis）、卵叶牡丹（Paeonia qiui）、杨山牡丹（Paeonia ostii）、紫斑牡丹（Paeonia rockii）、四川牡丹（Paeonia decomposi⁃ta）5 个种；肉质花盘亚组包括4 个种，即紫牡丹（Paeonia delavayi）、黄牡丹（Paeonia lutea）、狭叶牡丹（Paeonia potaninii）、大黄花牡丹（Paeonia lud⁃lowii）［4-5］。牡丹因花大色艳、品冠群芳，故有“花中之王”、“国色天香”的美誉［7-8］，具有观赏、药用和食用价值［6-8］。

目前对于牡丹的研究，主要集中在野生种分类、栽培品种分类、遗传多样性以及文旅等方面，而对其生殖生物学方向的研究尚未全面报道［9］。因此对牡丹花部特征、开花物候、传粉、花粉活力、结实特性、种子休眠与萌发等生殖生物学特性进行了归纳，以期为相关研究工作提供理论依据和有利的参考。

1 牡丹的地理分布

牡丹原产中国，其适应性强，可耐干旱。牡丹最大最集中的栽培区是菏泽、洛阳、北京、临夏、彭州、铜陵县等。通过中原花农冬季赴粤、闽、浙、深圳、海南进行牡丹催花，促使了牡丹在以上几个地区生殖发育，使牡丹种植遍布到中国各省市自治区［10］。事实上，经过2 000 多年的生产实践，我国栽培牡丹的多样性不仅更加丰富，而且对环境的适应能力也增强，基本形成了以我国中原、西北、江南及西南地区为主的几个品种群［11-12］（表1）。

表1 牡丹四大栽培品种群Table 1 Four major cultivars of peony

2 牡丹开花生物学研究

牡丹开花生物学包括花芽分化、花部构成、配子体的发生和发育、开花物候等过程［13-14］。

2.1 牡丹开花物候及花部特征

开花物候是牡丹生殖生物学研究的重要环节之一，包括开花的起始时间、开花高峰期和末花期，它对牡丹结实成功具有重要影响［15］。对比全国各地牡丹的花期表征，我们可以看出，通常花期时间差异较大，如河南省洛阳市最长为17 d，同一地区不同品种的开花物候也有较大的差别，因而有早、中、晚花的区分。

花部特征：单花生于枝梢，直径10～17 cm；茎长4～6 cm；绿色，苞片长圆形，数量5枚；绿色萼片，5 枚，匙形或卵圆形，顶端急尖；花冠放射状，花基部盘绕卷曲；花瓣5 枚，或重瓣，粉红色、红紫色、粉红色至白色，倒卵形，长5～8 cm，宽4.2～6 cm，先端呈不规则波浪形；花药扭曲缩短，长圆形，长4 mm；花丝从开花到凋谢均纤细，紫红色和粉红色，上部为白色，长约1.3 cm；花盘革质，杯状，紫红色、黄色、绿色，先端有数个尖齿或裂片，完全包围心皮，心皮成熟后干燥，2～6 枚，无毛，有光泽，颜色随柱头变化而变化。自然花期为3月中旬～6月上旬，单花的花期约 3～10 d，群体的花期在 20～30 d［16-17］，并且每年只开花一次。

2.2 牡丹花芽分化

花芽分化是开花过程中非常重要的一步，直接影响着开花的数量和质量。牡丹作为中国的传统名花，其花芽分化不仅对其自然花期观赏价值有着重要影响，也是进行花期调控的重要依据［18］。牡丹的花芽分化通常在6 月初开始，在9 月下旬至10 月中旬结束，雌蕊和雄蕊的瓣化主要发生在11月至下年年初，其分化进程依照萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊（心皮）的顺序进行［19-20］。但是，花芽分化过程发生的时间因植株的条件和品种不同而不同。国内对牡丹花芽分化的研究主要集中在分化类型和分化进程上［21］。贺丹等［22］采用石蜡切片技术和观察测量方法对牡丹栽培品种——凤丹进行了观察，根据切片显示，牡丹花芽为混合芽，大致分为早期花芽分化、苞片初生分化、萼片初生分化、花瓣初生分化、雄蕊初生分化和雌蕊初生分化六个时期。杨正申等［23］选取27个牡丹品种研究花芽分化，发现分化可分为幼叶分化完成、花被分化和雌蕊分化三个时期，并以此将牡丹分为‘赵粉型’、‘樱落宝珠型’和‘洛阳红型’。花芽分化速度快、完成时间早的牡丹品种更容易用于栽培试验。来自中原地区的中国牡丹品种，其花芽分化开始时间在日本比中国稍晚，可作为节日花材推广。

3 牡丹传粉生物学研究

花粉是种子植物的雄配子体，在生殖过程中起着重要的作用［24］。花粉储存常被用来延长亲本不开花授粉的植物的寿命。在授粉前一般都进行萌发率的测定，确定花粉是否具备受精能力。测定花粉萌发率的主要方法有三种：离体萌发、活体萌发和用氧化还原染料的非萌发分析测定法［25］。花粉萌发率的测定对于杂交育种工作具有重要的意义，这样可以减少工作浪费，提高生殖效率。

3.1 花粉活力研究

花粉活力的高低直接影响生殖的效率和成功率，是人工授粉、辐射诱变和花粉培养的必要条件，在使用花粉前应进行测定［26］。目前，花粉活力的测定一般用染色鉴定法和离体萌发测定法。

3.1.1 花粉活力测定方法

3.1.1.1 染色鉴定法

染色有三种染色方法：醋酸洋红、碘-碘化钾（I2-KI）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑法（2，3，5-triphe⁃nylte-trazolium chloride，TTC），TTC 是测定花粉的活力和寿命最常用的方法。具体方法是：将同一朵花不同时间和同一植株的不同花朵在同一时间散出的花粉撒在载玻片上，滴加含有0.5%TTC 的蔗糖溶液，迅速盖上盖玻片，放在平板上，内有湿滤纸，将平板置于37℃黑暗中2 h。对盖玻片中心观察到的所有花粉中红色花粉的比例的3～5 个视野进行计数［27］。TTC 法的优点是检测速度较快，但在测定过程中出现过渡色，颜色鉴别有困难，测定结果往往偏高。

3.1.1.2 离体萌发测定法

离体萌发测定法对所有贮藏花粉或新鲜花粉都适宜，并能测出相对萌发率，花粉萌发率直接关系到植物生殖能力及价值［28］。离体萌发测定法需要特定的培养基来培养花粉，常用的培养基有液体和固体两种，其中液体培养分离法最为方便。在恒定的培养条件和温度控制下，可以通过离体培养时的发芽率来测定花粉的成活率，这种方法的优点是简单、快速、合理，完全可以定量［29］。但花粉发芽条件如养分、温度和培养时间以及矿物质元素等对离体萌发法测定花粉成活率有很大影响［30］。

3.1.2 花粉培养条件

蔗糖是大多数植物花粉培养物的重要成分，因为它能为花粉发芽和花粉管生长提供营养，还能维持外界环境中恒定的渗透压，不同品种的牡丹对蔗糖浓度有不同的需求［31-32］。黄牡丹［33］（Paeonia dela⁃vayiFranch.）花粉萌发所需蔗糖浓度为80～140 g/L。矮牡丹［34］花粉萌发所需蔗糖浓度为80 g/L。盖伟玲［35］研究了鲁荷红牡丹（Paeonia suffruticosacv.Luhehong）、杨山牡丹（Paeoniaostii.）、卵叶牡丹（P.qi⁃ui）、紫斑牡丹（P.rokki）4 个牡丹品种的花粉萌发情况，发现当蔗糖浓度增加时，4 个牡丹品种的花粉表现出先上升后下降的趋势，当蔗糖浓度为100 g/L时，四种牡丹萌发率最高。

硼酸是牡丹花粉萌发的必要条件，它对花器官的形态结构、花粉发芽、花粉管的生长和受精有很大的影响，缺硼会导致开花不受精。硼酸作用于质膜上的Ca2+通道，使Ca2+进入细胞，增加细胞内游离Ca2+的浓度，启动花粉萌发［36］。牡丹所需要的硼酸质量浓度一般在30～80 mg/L。钙是雌蕊中花粉管生长的必要条件，也是通过化合反应促进花粉管的生长。钙是花粉萌发和花粉管生长最重要的信号，在花粉萌发过程中，钙可以代替群体效应。离体花粉的培养基中必须有Ca2+，并且钙的浓度一定要适当，当钙浓度较低或培养基中没有钙时，花粉管末端可能会膨胀断裂，当钙浓度较高时，花粉管停止生长［37］。牡丹花粉萌发所需Ca2+质量浓度为20 mg/L 时与蔗糖、硼酸两两组合后对萌发率有非常显著的影响。

3.2 花粉胚株比（Pollen-Ovule Ratio，P/O）

花粉-胚珠比率（P/O）是用每朵花的估计花粉量数除以每朵花的胚珠数来确定的。Cruden 通过研究认为P/O值可以指示植物的繁育系统，因为P/O值反映的是大量花粉都能到达柱头所形成最高结实率，P/O 值越低，花粉传递越有效［38］。平均花粉量通常采用在光学显微镜下用血球计数器来计算［39］。胚珠数是统计植株结实率的重要指标之一，常用的方法是直接观察法，即用解剖刀和镊子等打开子房，在解剖镜下观察胚珠个数。

3.3 柱头可授期

柱头可授期是花朵成熟的重要时期，也是人工授粉的重要参考指标［40］。柱头可授性通过联苯胺-过氧化氢法测定，即在牡丹开花期旺盛时，每天中午采开花后不同天数的花朵，将其柱头浸入含有联苯胺-过氧化氢反应液凹面载片中（1%联苯胺：3%过氧化氢：水=4：11：22）的凹陷处，如果柱头可育，则柱头周围的反应液为蓝色，并出现大量气泡［41］。根据李奎等［42］研究发现，滇牡丹开花后第一天至第三天的授粉率超过70%以上，但授粉率在开花后四天急剧下降，柱头变黑变硬后失去了产生花粉的能力。杨勇等［43］对四川牡丹的柱头进行了可授性测定，发现四川牡丹柱头可授性持续了9 d，在开花的第5～8 d最强。

3.4 访花昆虫

虫媒植物利用花蜜、花粉、颜色和气味等花卉特性的综合作用，吸引开花昆虫到其花上传粉，不同植物的花吸引不同类型的昆虫，有时形成特定的传粉关系［44］。以昆虫为媒介的植物必须依靠传粉昆虫来完成卵受精过程，这种植物的开花生物学对昆虫的活动规律和花粉传递有重要作用，同时昆虫的行为对植物的成功繁殖起着至关重要的作用［45］。

牡丹是典型的虫媒植物，主要的传粉昆虫是蜂类、甲虫类和蝇类。虽然许多昆虫都能为农作物授粉，如双翅目的蝇类、鳞翅目的蝶类和鳞翅目的蝶类等［46］。但膜翅目昆虫以其独特的形态结构和生物学特性，是最主要的传粉昆虫［47］。罗毅波等［48］连续两年对山西省三个矮牡丹居群进行了实地观察，发现共有5 种蜂和4 种甲虫参与矮牡丹的传粉。通过电镜观察和人工控制昆虫传粉试验证明蜂类，特别是地蜂类是矮牡丹的主要传粉者，而甲虫只是不稳定的传粉者。

表2 已发表的常见牡丹传粉昆虫Table 2 Common pollinators of Peony published in journals

3.5 繁育系统检测

繁育系统的检测是传粉生物学中不可缺少的一部分，一般是采用套袋和人工授粉等方式［49］。李奎等［50］人研究滇牡丹的繁育系统，发现滇牡丹是异花授粉植物。为了提高滇牡丹结实率，可以在特殊天气条件下使用人工授粉，也可在花期人工放蜂，增加访花者数量来提高传粉力度。种子的结实主要取决于传粉昆虫的活动，通过异花传粉携带的异质基因可以进一步增强后代的变异性和适应性。罗毅波等人对矮牡丹的试验结果表明，居群间人工杂交和自然授粉的结实情况在“永济Ⅰ”居群中基本相似，但在“稷山Ⅱ”居群中，则居群间人工杂交的结实情况远好于自然授粉的结果。在居群间人工杂交情况下“永济Ⅰ”和“稷山Ⅱ”居群的结实情况则基本一致［48］。所以，研究者们认为‘矮牡丹’的结实情况存在一定预知情况，在这个预知情况的范围内，随着传粉过程的改变，结实情况会有所好转。

4 牡丹种子生物学特性

种子是植物的主要生殖器官，是种群延续的重要纽带，也是长期保存种质资源的理想材料［51］。种子特征包括形态和生理两个方面，其中，种子微形态不易受环境影响，具有一定的稳定性［52-53］。

4.1 牡丹种子的形态结构和结实特性

牡丹的果实为蓇葖果，呈纺锤形、椭圆形、瓶形等；有光滑或细密的绒毛。2～8 枚离生，由单心皮构成，子房1室，内含种子多粒，黑色或黑褐色，呈圆形、长圆形或尖圆形。不同品种的种子大小、色泽等也不同［54］。牡丹种子由种皮、胚、胚乳三部分构成［55］，由于牡丹结实率较高，种子在果实中分布不均匀，相邻种之间相互挤压，形成不规则的种子形状。牡丹种子的胚一般为匙形，发育不完全，因此需要在种子成熟后进一步发育［56］。种胚仅占新鲜成熟种子的一小部分，其余大部分为胚乳［57］。

牡丹的蓇葖果五角，每个果角结籽7～13 粒，表皮初为绿色且多毛，成熟时变为蟹黄色，种籽为黄绿色，成熟时果角干枯，种籽为黑褐色，千粒重约400 g，但种籽仅有部分可育性［58］。

4.2 牡丹种子休眠及萌发特性

牡丹繁殖可分为种子繁殖和无性繁殖两种［59］。种子繁殖系数大，可以在短期内获得大量苗木，但实生苗变异大，不易保持母本的优良性状。因此种子繁殖常用于药用牡丹、新品种的选育。种子萌发则是种子繁殖的关键环节，种子萌发成苗的质量和周期直接影响牡丹种苗的产量和效益。因此，关于牡丹种子的休眠和萌发的相关研究引起了人们广泛关注［60］。牡丹种子的休眠特性包括胚根（下胚轴）和胚芽（上胚轴）的休眠，其中上胚轴的休眠更为明显［61］。种子萌发过程呈现出阶段性变化，需要相应的温度变化过程，不过不同种类之间，不同种类的种子萌发阶段所需的温度和时期的长短不一［62］。

4.2.1 种子休眠原因

种皮受损是影响植物种子休眠的因素之一，但是否是造成种子休眠的主要原因，各植物的情况不同。牡丹种子种皮较硬，木质化程度高，严重影响了种子的吸水速度和种子的透气性，不利于种子萌发［63］。

牡丹种子中存在的发芽抑制物质是导致种子休眠的重要原因。宋会兴［64］在四川牡丹种子提取出了抑制萌发的物质，能够抑制油菜种子萌发，这是四川牡丹种子休眠的重要原因。郭丽萍等［65］发现凤丹和紫斑牡丹的种子种皮和胚乳中存在较强的抑制物质，能够抑制白菜种子萌发和自身种子的萌发。

牡丹果实成熟后，种子胚芽发育不完全，并处于一定程度的生理休眠状态，必须在一定条件下完成形态及生理后熟才能萌发，种胚形态及生理发育不成熟也是导致牡丹种子休眠的重要因素［66］。

4.2.2 种子休眠的破除

目前对牡丹种子休眠解除方法的研究主要从温度、外源激素、种皮结构等方面入手。关于温度，主要研究了层积积温和低温春化两种最有效的温度。温度对牡丹种子的萌发及胚伸长起着明显的作用，不同的牡丹品种对层积的温度要求不同。马宏等［67］对大花黄牡丹种子休眠解除研究表明温度对大花黄牡丹种子萌发有显著影响，在温度低于10℃和高于25℃时生长的种子不发芽，解除种子休眠的最佳温度为15～20℃。根据郑相穆等［68］人对‘凤丹’种子的观察，‘凤丹’种子需要经历25℃暖温长根阶段和5℃低温春化长芽阶段。

植物激素对牡丹种子萌发的主要影响是赤霉素（Gibberellin A3，GA3）的使用，种子生根后，低温和GA3处理均能有效地解除上胚轴休眠，促进芽的形成。外源激素可以通过改变内源激素的含量而调节种子休眠与萌发。范丙友等［69］研究发现用200 mg/LGA3处理已生根凤丹种子，能有效打破凤丹种子的上胚轴休眠，从而使其发芽率达90.1%。娄方芳等［70］用 200 mg/LGA3溶液浸泡 24 h 处理过的已生根种子，放置在15℃条件下，不仅发芽时间缩短，而且发芽率也明显提高。

根据刘敏淑、王莲英等［8］人所述，种皮的透水和透气性是影响种子萌发的重要因素，并提出在浓硫酸中浸泡2～3 min，或在95%的酒精中浸泡30 min，均可软化种皮并促进萌发。然而，景新明等［71］人认为，使用化学或物理方法来处理牡丹种皮，对种子休眠的打破效果并不显著，反而会引起霉菌侵染。郭丽萍等［72］研究中发现凤丹种皮对种子的吸水率有一定的影响，而当吸水率达到吸水饱和时则没有影响。种皮的通透性不是牡丹休眠的主要原因，但是木质化的种皮可能会对种子萌发造成一定的机械阻力。

4.3 牡丹种子的采收及贮藏

牡丹种子从8月初到9月中旬成熟，而5年生以上的牡丹种子相对饱满，发芽率高。种子的成熟有早有晚，应分阶段和分批收获，如果采收时间过早，种子将不成熟，如果采收时间过晚，则种皮将变黑发硬不易出苗［73］。当果实的角呈蟹黄色时，将果实摘下并放在屋内凉爽潮湿的地面上，让果壳中的种子成熟。每天翻动1次，以防止底部变热，并且防止外部干燥和硬化。种子从果壳中黄绿色变为褐色，再变为黑色，10～15 d后，大多数果皮逐渐破裂并释放出种子。此时，不需将果皮与种子分离，并保存在其原始位置以备后用，严禁将它曝晒在阳光底下使种皮变硬，等到种植前1 d再将种子拣出［74］。

将晾干的种子放在干净的河沙上，以1：3 的比例混合，将温度控制在1～10℃，湿度控制在60%左右（用手将河沙捏成团，松开不散，手掌湿润，但不见水滴时的湿度），贮藏4 个月。在贮藏期间，应翻动2～3次，同时注意通风和保湿［75］。

5 总结与展望

牡丹是典型的虫媒植物，为了提高牡丹结实率，我们可以在牡丹花期通过人工释放蜂增加访花者数量来提高传粉力度或相应地降低居群内其他植物的郁闭度，并在一定的天气条件下（如阴天或雨天）采用人工授粉，为后代环境变化的适应性创造条件，促进牡丹活株的形成。种子是植物的主要生殖器官，牡丹的品种培育通常采用种子繁殖，而种子萌发是种子繁殖的关键。大多数牡丹都有上胚轴形态生理休眠的特性［63］，种胚分化但未完全发育，在胚根突破种皮之前，种胚必须达到一定的长度。因此，牡丹种子的萌发需经历暖层积打破种胚的形态休眠和胚根的生理休眠。GA3和低温处理均可有效打破牡丹种子的上胚轴休眠，可以促进牡丹种子的发芽，缩短牡丹实生苗的成苗时间，进而提高牡丹的结实率［76］。

随着时代的进步，对牡丹观赏性状及适应能力均提出了更高的要求。这就需要不断地培育新优品种以满足人们日益增长的需求。近年来，由于缺乏对牡丹资源的保护和非本地区的盲目移植，以及开花和种子结实率低，导致牡丹品种急剧下降。为此研究牡丹的开花物候、花粉活力、繁育系统特征、种子的休眠与萌发特性尤为重要。对牡丹生殖生物学的详细研究不仅为牡丹优质高产的栽培提供了理论依据，也为牡丹优质高产品种的培育提供了参考。