鸭坦布苏病毒纳米PCR方法的建立及应用

李得鑫,李佳暖,李富言

（1.山东畜牧兽医职业学院 261000；2.山东富言禽病研究院 261100）

鸭坦布苏病主要危害对象是蛋鸭，主要特点是蛋鸭产蛋下降[1]。目前快速诊断该病的方法有PCR、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR、RT-LAMP等方法。这些方法的优点很明显，检测快速，敏感性更高，但是荧光定量PCR所需的仪器很昂贵，LAMP对环境要求很严格，容易形成气溶胶。由于这些缺点，导致这些方法在临床应用时很受局限[2]。为了改善这种情况，本研究针对鸭坦布苏E基因，建立了一种快速、灵敏、特异的纳米PCR 检测技术。

1 材料

1.1 病原

实验室分离的鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭病毒性肝炎（DHV）、鸭瘟（DPV）、鸭病毒性肠炎（DEV）毒株。

1.2 试剂

由全式金（北京生物科技有限公司）生产的Mark2K，Nano试剂盒。

2 方法

2.1 引物设计

以GeneBank：KC136210.1 E基因为模板，应用primer5软件设计扩增DTMUV的E基因的348bp目的片段的引物。引物由瑞普公司合成。

表1 引物信息

2.2 RNA的提取

250μL病毒与750uL Transzol混合，强烈振荡5min，静置5min；加250μL氯仿，剧烈振荡1min，静置5min，4℃，12000r/min, 15min离心；吸取上层液体600μL于EP管中，加等量异丙醇，混匀后，室温静置15min, 4℃, 12000r/min, 15min离心; 弃上清加900μL DEPC水酒精，4℃，12000r/min, 8min;弃上清，离心12000r/min, 3min; 利用移液枪枪吸取剩余上清液，超真空干燥；最后加上9.5μL溶解液。

反应条件优化 DTMUV最佳的纳米PCR反应体系为：2×Nano Buffer12.5μL，F1为0.5μL，R1为0.5μL，cDNA为1μL，ddH2O为10μL，Tap酶为0.5μL；最佳PCR反应条件为94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 21s, 30个循环；72℃5min。

敏感性的检测 模板浓度经检测为3.7ng/μL，为得到浓度梯度标准品，将模板用溶解液按10倍倍比稀释溶解，分别利用纳米PCR和普通PCR这两种方法对稀释后的模板进行扩增，比较二者的敏感性。

特异性的检测 利用设计的引物对DTMUV、DHV、DPV、DEV进行特异性检测。

3 结果

3.1 从电泳图1可以看出，DTMUV的348bp的目的片段被成功检出。

图1 DTMUV检测结果

3.2 将电泳图2进行比较，Nano PCR的敏感度可达104，可检测到最低浓度为3.7×10-4ng/μL，PCR的敏感度可达到103，可检测到最低浓度为3.7×10-3ng/μL，由此可知，Nano PCR的敏感性是PCR的10倍。

图2 Nano PCR 敏感性检测结果

3.3 从电泳图3可以看出，4个病毒株中，只有DTMUV检出目的条带，其他病毒均未检出条带，无交叉反应。

图3 DTMUV特异性检测结果

4 讨论

鸭坦布苏最先是在2010年4月份我国南方部分地区发现，不仅感染种鸭，还感染各种蛋鸭，是一种新兴的传染病[3]。主要的临床特点是体温居高不下，蛋鸭的产蛋量急剧下降[4]。剖检后可见病死鸭肝脏有白色点状出血，伴随肿大，卵泡膜充血、出血，卵泡变性等病理变化[5]。群内发病率几乎100%，病死率不是太高，约为0%～28%不等[6]。该病引起的产蛋急剧下降这种危害给蛋鸭养殖户造成的损失严重，给养殖业也造成很大的影响。因此，建立一种快速、灵敏的检测技术，为更好的防控该病刻不容缓[7]。

在临床应用中，各种不同的检测方法有不同的优缺点，较为常用的是普通PCR，但其敏感性不显著，效果不明显；LAMP缺点是对环境要求很苛刻，容易形成气溶胶，荧光定量PCR虽然较为精准，但需要精密昂贵的仪器并且操作程序复杂[8]。本研究首次针对DTMUV 的E基因建立了一种纳米检测 PCR 技术，这种方法可以快速、敏感、特异的对DTUMV 进行检测。纳米PCR是一种新型的 PCR 技术，集各种优点于一身，相比较普通PCR更加敏感，比荧光定量PCR更加方便快捷[9]。纳米PCR的快速、灵敏、特异主要取决于纳米PCR缓冲液中的粒径为1nm-100nm的纳米金属颗粒，这种颗粒可悬浮于液体中，构成纳米流体。纳米流体的导热性能更好，可以明显提高反应体系的温度变化速度，所以能更快达到目标温度，减少反应体系在非目标温度的停留时间。同时，特异性反应时间增加，因而最终达到消除非特异性扩增，提高扩增效率和敏感性的目的[10-13]。本研究首次针对DTMUV 的E基因建立了一种纳米检测 PCR 技术，这种方法可以快速、敏感、特异的对DTUMV 进行检测。

5 结论

本研究表明纳米PCR的最小检出量为3.7×10-4，PCR的最小检出量为3.7×10-3， DTMUV的敏感性试验证明纳米PCR方法的敏感性是普通PCR的10倍。该DTMUV纳米PCR这种检测方法敏感性更高，特异性更强，是一种高效的检测手段，可以应用于流行病学调查，同时也为 DTMUV的及时检测、预防和治疗奠定基础。