广西部分地区蛇源性细菌的耐药性分析

张美晨，陶 飞，白慧丽，李常挺，曾 芸

（广西大学动物科学技术学院 530004 ）

蛇败血症的主要致病菌包括肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌、枸橼酸杆菌和鲍曼不动杆菌，正常情况下，粪肠球菌在蛇的消化道内其菌群维持在一定的平衡状态，通常是不会引起发病的[1]，但是当蛇由于病毒或细菌感染引起免疫功能下降时，粪肠球菌就会成为条件性致病菌，也会感染蛇，引起蛇发病[2]。细菌产生耐药性，通常是由于产生灭活药物的酶类、改变药物作用的靶位或降低细胞膜的通透性等[3]。在长期使用抗菌药物的状态下，致病菌主要是由于基因突变或细菌间耐药基因的转移产生耐药性[4]，而后者是目前致病菌产生耐药性的最重要因素[5]。目前，蛇源性致病细菌的研究较少，其耐药情况尚不明确。从广西各地的蛇败血症病例中分离获得的细菌呈现不同程度的耐药，本文通过体外抑菌试验结合耐药基因检测，了解并掌握引起蛇发生败血症的细菌及其耐药性情况，观察蛇类中是否已出现“多重耐药性细菌”[6]，为细菌感染的合理防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细菌来源

2016年7月到2017年7月，广西大学动物科学技术学院药理实验室从广西各地蛇场送检的蛇败血症病例中分离纯化出7种23株细菌，分别编号为A、B、C、D、E、F、G，如表1。

表1 细菌种类

1.2 体外抑菌试验

将细菌分别接种于适宜的培养基，37℃恒温培养24 h，用细菌间接计数的麦氏比浊法配制菌悬液浓度为3×109cfu/mL，采用纸片法进行体外抑菌试验[7]，每株细菌每个药物做三个平行，按照临床和实验室标准化委员会(CLSI)的标准进行结果判定，抑菌圈直径(Φ)＜10 mm为不敏感，即耐药(R)，10 mm≤Φ＜15 mm为低敏或不敏感，即中敏(I)，Φ≥15 mm为敏感(S)。

1.3 耐药基因检测

根据体外抑菌试验结果，总结出分离得到的细菌对常用抗菌药物所耐受的种类，并根据各类药物及各种细菌的常检耐药基因，筛选出最终所用的耐药基因，并设计相关引物，具体引物名称、序列及退火程序见表2，引物由广州金唯智生物科技有限公司合成。将同种细菌分为一组，每组根据对应的耐药基因的PCR反应条件分别进行扩增。PCR反应体系(50 μL):2×TaqMaster Mix(Dye)，25μL；ddH2O，17μL；上、下游引物(10μmol/L)各2μL；DNA模板，4μL。PCR反应结束后进行凝胶电泳(120v 100mA，25min)并观察扩增结果。

表2 耐药基因检测所用引物

2 结果与分析

2.1 体外抑菌试验结果

7种23株细菌的体外抑菌结果如表3所示。按药物分类分别对这7种细菌进行单因素方差分析，结果为不同细菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类和大环内酯类药物的耐药性差异极显著P＜0.01（α=0.05），而对四环素类和喹诺酮类药物的耐药性没有显著差异。

表3 7种23株细菌的体外抑菌试验结果(单位：mm)

表中同种细菌不同株的相同药物的体外抑菌试验结果取平均值。

2.2 耐药基因检测结果

通过电泳凝胶成像仪得到各产物的电泳图像（图1），由图可知A组中5株来源不同的肺炎克雷伯菌中A1、A3、A5这三株菌检测到耐氨基糖苷类药物的耐药基因aac(3)-Ⅱ，这与2.1中肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗生素中的庆大霉素和链霉素表现为耐药相符合。C组中8株来源不同的粪肠球菌，只有C2、C5两株菌检测到erm(B)耐大环内酯类药物的目的基因，这与上述粪肠球菌对大环内酯类抗生素中的红霉素和泰乐菌素表现为耐药相符合。D组中2株来源不同的肠道沙门氏菌中D1株检测到SUL1耐磺胺类药物的目的基因，这与上述药敏试验结果不符合，但仍能表示该株菌含有耐药基因。其余细菌均未检测到相应的耐药基因。

图1 耐药基因PCR反应结果

3 讨论

广西各地送检的蛇败血症病例共19例，且送检前的用药情况不同，其中部分用过多西环素和土霉素，部分用过阿莫西林和恩诺沙星，其余的还用过氟苯尼考进行治疗，但疗效均不佳。经过剖检及细菌分离，从病例中共分离获得7种23株细菌，即8株粪肠球菌、5株肺炎克雷伯菌、3株鲍曼不动杆菌、3株普罗威登斯菌、2株肠道沙门氏菌、1株枸橼酸杆菌、1株摩氏摩根菌。从体外抑菌试验结果来看，肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗生素耐药，粪肠球菌对大环内酯类抗生素耐药，普罗威登斯菌对β-内酰胺类抗生素耐药，肠道沙门氏菌对恩诺沙星耐药，枸橼酸杆菌对头孢拉啶耐药，摩氏摩根菌对青霉素和头孢拉啶耐药，不同细菌对不同抗菌药的耐药趋向表现无规律，但有普遍发展的趋势[8]。

从耐药基因检测结果来看，检测到的耐药基因有一定的代表性。粪肠球菌易对大环内酯类药物产生耐药性[9]，其中对红霉素的耐药性最为严重，一般采用检测与红霉素相关的甲基化酶基因erm(A)、erm(B)、erm(C)来断定耐药机制，通常erm(B)基因的阳性检出率最高。本次试验所用到的8株粪肠球菌，其耐药基因erm(B)的阳性检出率为25%(2/8)，这与黄震等人关于粪肠球菌对泰利霉素药物敏感性与耐药基因erm的分布[10]的研究不符，可能是由于样本数量过少。细菌对氨基糖苷类药物产生耐药性，通常是由于其产生了氨基糖苷类钝化酶，而这类酶又分为磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)和乙酰转移酶(AAC)[11]。其中在耐氨基糖苷类药物的细菌中，最易检出AAC，而在耐氨基糖苷类药物的肺炎克雷伯菌中，最易检出的耐药基因为aac(3)-Ⅱ[12]。本次试验所用到的5株肺炎克雷伯菌，其耐药基因aac(3)-Ⅱ的阳性检出率为60%(3/5)，具有一定的代表性。磺胺类药物的耐药基因检测通常包括SUL1、SUL2和SUL3[13]，而本次试验所用到的2株肠道沙门氏菌则进行了SUL1耐药基因的检测，其阳性检出率为50%(1/2)，说明该耐药基因已在蛇源性细菌中存在，但与上述体外抑菌试验结果不符合，可能是由于菌株数量过少，所以不具有统计学意义[14]。其余耐药基因的检出率为0，可能是蛇源性细菌还未携带或产生该基因，或者是本次试验中分离到的菌株数量过少所致。但本试验仍能体现出抗菌药物的滥用，导致细菌产生耐药基因的普遍性。