孢粉化石提取和扫描电镜样品制备

于洋，张艳

吉林大学 古生物学与地层学研究中心，长春 130026

0 引言

孢粉学(palynology)是研究蕨类植物孢子和裸子植物花粉及被子植物花粉的科学，作为地学和生物学的交叉学科发展迅速[1--2]。孢粉学的研究对象主要为现代孢粉和化石孢粉。所谓化石孢粉就是当孢子和花粉在孢子囊和花药中成熟之后，经过风、水或动物等动力飞离植物母体，大部分落在土壤中，经过漫长的地质年代土壤变成了岩石，而这些保存在岩石中的孢子和花粉即成为化石孢粉[3]。孢粉产量大、易被搬运、孢粉壁易于保存，因此地球表面孢粉非常丰富，在很多领域有着广泛的应用。在地质方面，孢粉可以确定地层时代与地层划分和对比[4--5]；在地理方面，孢粉分析资料可再造古植被，恢复古地理、古气候[6--7]；在油气和煤炭形成的原始物质及其勘探、开发中，孢粉学可提供重要的佐证[8--10]；在考古方面，应用孢粉分析可以了解古代人类生活环境[11--12]等。埋藏在岩石中的孢粉，不经过一定的化学处理把其从岩石中分离出来是不宜在显微镜下观察和研究的。另外孢粉个体很小，表面上的纹饰细微，光学显微镜分属定种非常困难，而扫描电镜具有放大倍数大、分辨率高和立体感强的优点，已被广泛用于孢粉学的研究[13]。但目前关于孢粉化石提取和扫描电镜样品制备的详细方法的公开报道较少。笔者结合实验室工作经验，报道了一般岩样(泥质岩、粉砂岩和灰岩类)孢粉化石的提取和扫描电镜观察样品的制备方法，以期为相关科研人员在工作中提供参考。

1 材料

扫描电镜观察的孢粉样品取自吉林省辉南县东南龙岗山脉中部的二龙湾玛珥湖岩芯。二龙湾地区(42°18′N, 126°22′E)是新生代以来中国东北东部地区形成的龙岗火山群，气候属于典型的季风影响下的温带山地气候，年平均降水量为500～800 mm，冬天最低温度为-39 ℃，夏天最高温度为37 ℃，植物区系属“长白山植物区系”。在野外钻取岩芯，岩芯长度2 400 cm，AMS14C年龄为0.5～32 ka B.P.[14]。

2 实验方法

2.1 化学处理

孢粉化石的提取就是通过一定的化学处理把孢粉从岩石中分离出来。对不同的样品，由于其沉积环境、介质条件和岩石类型的不同，所用的化学试剂及其浓度、分析过程会有所不同，实验中要根据岩石类型和有机质含量选择合适的处理方法。本文介绍一般岩样(泥质岩、粉砂岩和灰岩类)孢粉的提取流程(图1)。

图1 孢粉化石提取流程Fig.1 Sporopollen fossil extraction process

(1)初步处理

① 清洁

对于较硬的样品，可用水反复冲刷直到附着的污染物完全除去，而后烘干。对于较松软的样品可用小刀刮去表层污染物，而后烘干。对于灰岩和白云岩之类的样品，可用3%～5%的稀盐酸浸洗，剥去表层，再用水冲干净烘干待用。

② 取样

孢粉分析取样量决定于岩性。富含有机质的碳质页岩、黑色泥岩取30～50 g；泥质粉砂岩、粉砂岩和砂岩取100～150 g；纯灰岩、灰岩和石膏等取100～300 g；砂砾岩、含盐岩样，取500～1 500 g，用清水淘洗和用热水泡出这类岩样中的泥砂部分作为分析材料用。

③ 碎样

泥质岩，粉砂岩类的样品，碎样过孔径0.5 mm的筛子；灰岩因为与酸作用十分剧烈，很容易溶解，碎到1～2 cm即可。

(2)化学处理

① 加稀盐酸(HCl)

将已过筛称重的样品装入1 000 mL的玻璃烧杯中，加入浓度为18%的稀盐酸溶液，加盐酸的量约为样品体积的一倍左右，用玻璃棒充分搅拌，然后放置2 h，让其充分反应，直到起泡现象完全停止。盐酸除能溶解碳酸盐以外，铁和铝的不同状态的大量三、二价氧化物也能被溶解。

② 加水洗涤

反复洗涤3～4次，注意保留水面上的悬浮物质，直到pH=7。

③ 加氢氟酸(HF)

将样品转入1 000 mL的塑料烧杯中，慢慢地加入浓度为40%的氢氟酸，其量应该渗浸整个样品，并经常搅动样品让其充分作用，放置48 h。

④ 加水洗涤

重复步骤(2)，洗涤到pH=7。

⑤ 加浓盐酸

将样品转入1 000 mL的玻璃烧杯中，加入浓度为36%的浓盐酸溶液约100 mL，放在电炉上煮沸15 min±，除去氟化物，见到黏稠状混浊液变清或呈淡黃到黃绿色溶液止。

⑥ 加水洗涤

重复步骤(2)，洗涤到pH=7。

⑦ 重液浮选

将样品洗到中性后，吸去样品上部的水溶液，倒入50 mL容量的离心管中，用2 000 r/min的离心速度离心10 min，将水倒掉，加入2.25～2.2比重的重液(用碘化镉、碘化钾和蒸馏水配置)，加入量为样品体积的2～3倍。样品和重液一定要充分搅拌均匀，离心15 min(2 000 r/min)，分成两层，下部是岩矿颗粒，上部浮着的是孢粉和其他有机物。把上部重液部分慢慢倒入或用小吸管吸入原来的烧杯中，再用比重为2.15～2.1的重液进行第二次浮选。往往第二次浮选出来的孢粉比第一次要多，所以浮选最好进行第二次。将含有孢粉的重液加2倍水稀释，离心10 min(2 000 r/min)。将上部不含孢粉的重液倒入蒸发皿中回收，底部含孢粉的样品收集在小瓶中加水保存。

2.2 扫描电镜样品制备

为了得到理想的标本，可先将收集的含孢粉液体取一滴滴在薄片上，制成活动片，在水份没有蒸发之前立即在光学显微镜下观察，找到所需的孢粉后用挑针挑取孢粉，小心转移到黏有碳导电胶的电镜座上。或者用7 μm 孔径的筛布滤去水份，用黏有导电胶的电镜座黏取筛布上收集的孢粉。第二种方法收集的孢粉量更大，但是会有杂质。由于孢粉样品本身含水量少，孢粉壁不易变形，采用自然风干的干燥方法即可[15]。干燥后，用洗耳球吹拂保证黏牢，在离子溅射仪中喷镀铂金膜(20 mA, 105 s)，而后装入扫描电镜进行观察。

3 结果与讨论

二龙湾玛珥湖岩芯中的孢粉化石很多，类型也比较多，有乔、灌木植物桦木属、鹅耳枥属、胡桃属、榆属和栎属等；草本植物蒿属、莎草科、藜科和禾本科等；蕨类植物石松属、卷柏属和铁线蕨属等[14]。本文对胡桃属、鹅耳枥属、栎属和榆属进行观察描述。孢粉活动片照片在奥林巴斯光学显微镜下拍摄，扫描电镜照片在日本电子JSM--6700F型场发射扫描电镜下拍摄(图2)。

a1, b1,c1-胡桃属(Juglans L.)花粉; a2, b2, c2-鹅耳枥属(Carpinus L.)花粉; a3, b3,c3-栎属(Quercus L.)花粉; a4, b4, c4-榆属(Ulmus L.)花粉。图2 孢粉化石的光学显微镜照片(a1-a4)和扫描电镜照片(b1-b4，c1-c4)Fig.2 Light microscope images (a1-a4) and SEM images(b1-b4，c1-c4)of sporopollen fossils

胡桃属(JuglansL.)花粉呈扁球形(图2-a1, b1)，极面观为多边形，赤道面观为阔椭圆形。花粉粒比较大，具散孔，赤道面孔数为6个，一个极面有孔，另一个极面无孔。扫描电镜照片(图2-b1，c1)显示外壁具颗粒状雕纹。光学显微镜下表面光滑。

鹅耳枥属(CarpinusL.)花粉呈扁球形(图2--a2, b2)，一般极轴小于赤道轴，赤道面观为近圆形到阔椭圆形，极面观为圆形。孔处外壁外层一般不加厚，个别情形稍加厚，或多或少升高，突出于轮廓线，内层不加厚，往往在外层升高处中断，有时内、外层分界不清。扫描电镜下，外壁表面具颗粒。孔数为3个(图2--b2, c2)。光学显微镜下表面光滑。

栎属(QuercusL.)花粉多为近球形(图2--a3, b3, c3)，极面观为3裂圆形，具3孔沟(图2--a3, b3显示一侧的两孔沟，图2--c3显示另一侧的孔沟)，轮廓线为显著波浪形或者较平。扫描电镜照片(图2--b3, c3)显示外壁具颗粒状、小瘤状雕纹。光学显微镜下表面粗糙。

榆属(UlmusL.)花粉呈扁球形(图2--a4, b4)，具5孔，孔较小，近圆形。扫描电镜照片(图2--b4, c4)显示外壁具绉波状(脑纹状)雕纹，轮廓线呈波浪形，绉波状雕纹上有分布较密的颗粒。光学显微镜下表面具脑纹状纹饰。

用本实验方法提取的孢粉化石数量多，形态真实，结构完整。孢粉表面的雕纹大小、形态以及孔沟的差异明显，可作为分属定种的重要依据。光学显微镜下活动片和固定片中孢粉的纹饰立体感差，看到的多为纹饰在平面上的投影，有些表面纹饰看不到。而在扫描电镜下，可以从不同视角观察，具有很强的立体感，可以清楚地观察到瘤、颗粒和条纹等纹饰的差别，孔、孔沟的细节形貌清晰可见，弥补了光学显微镜的不足，为分属定种提供了有力依据。

4 结论

(1) 经过一系列化学处理得到岩石中的孢粉化石，制成扫描电镜样品进行观察。孢粉形态真实，结构完整。

(2) 相比于孢粉化石活动片和固定片，扫描电镜下能清晰地识别孢粉纹饰和孔沟细节，在分属定种工作中具有明显优势。