全自动二维液相色谱测定替考拉宁血药浓度

马爱玲，王漪檬，张伟，马培志

(河南省人民医院药学部，郑州大学人民医院，河南 郑州 450003)

替考拉宁(teicoplanin)为游动放线菌属发酵产生的一种新型杀菌性糖肽类抗菌药物，通过抑制细菌细胞壁的合成来抑制细菌生长。替考拉宁是继万古霉素之后的又一抗耐药菌药物，临床可用于治疗各种严重的革兰阳性菌感染，特别是对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)引起的感染有很好的疗效，是目前临床治疗多重耐药菌感染的重要抗生素[1]。近年来研究及临床实践中发现，替考拉宁临床应用个体差异大，有效血药浓度达标率低，尤其是高龄老年、重症患者等特殊人群，其病理生理的改变等因素导致药物分布与清除发生变化，进而影响血药浓度及治疗效果，监测替考拉宁血药浓度的必要性已被越来越多的研究所证实。因此，医生在使用替考拉宁进行治疗时，需及时对替考拉宁的血药浓度进行监测。替考拉宁由 10～11碳脂肪链组成，主要成分有5种，分别为TA2-1、TA2-2、TA2-3、TA2-4、TA2-5，其中以TA2-2为主，占总含量的40%以上，这些组分的极性和生物活性相似，为无定形粉末[2]。实验室在进行替考拉宁血药浓度监测时，多以TA2-2为监测目标。文献研究表明，患者的年龄、血浆蛋白水平及是否给予负荷剂量对替考拉宁血药谷浓度影响较大，以上影响因素常单一或多个存在于患者个体中，使得按推荐的标准剂量给药难以达到有效血药浓度或超过不良反应预警浓度，从而发生治疗无效、诱发耐药性或增加不良反应的情况[3]。因此，推荐在临床应用中积极开展替考拉宁血药浓度监测，为医生开具处方提供科学依据，也为患者的合理用药提供有力保障。本研究采用全自动二维液相色谱测定替考拉宁血药浓度的方法，操作简便快速，结果准确，自动化程度高，适用于临床工作中监测替考拉宁的血药浓度。

1 材料

1.1 仪器全自动二维液相色谱(FLC-2701+LC-20A+SPD-20A)系统由全自动二维液相色谱耦合仪FLC-2701(湖南德米特仪器有限公司)及岛津液相色谱LC-20A部件构成。SC-3610低速离心机(安徽中佳)；AUW120D电子天平(日本岛津)；WH-866旋涡混合器。

1.2 药品与试剂替考拉宁-1D移动相；替考拉宁-2D移动相；水为超纯水；替考拉宁对照品(中国食品药品检定研究院，批号130374-201002)；MPI-1(湖南德米特仪器有限公司)；空白马血清(北京政博伟业生物科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件一维流动相为替考拉宁-1D移动相，二维流动相为替考拉宁-2D移动相，辅助试剂为超纯水。流速：A泵为1.2 mL·min-1，B泵为2.0 mL·min-1，C泵为0.8 mL·min-1。紫外检测波长为278 nm和254 nm。柱温40 ℃。进样量100 μL。时间程序0.01～4.00 min目标物转移至中间柱；4.01～6.00 min目标物从中间柱转移至二维色谱柱；6.01～13.50 min目标物在第二维色谱中完成分离。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品贮备液的制备 精密称取替考拉宁对照品24.00 mg于10 mL量筒中，用体积分数10%的甲醇溶解并定容，制备成2.40 g·L-1的替考拉宁对照品贮备液，置于-30 ℃ 冰箱中保存备用。

2.2.2质控血清的制备 精密量取替考拉宁对照品贮备液适量，分别加入适量空白马血清，制成10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉宁低、中、高质量浓度质控血样，置于-30 ℃冰箱中保存备用。

2.3 样品处理及测定精密吸取1 000 μL MPI-1至1.5 mL离心管中，加入400 μL血样，涡旋振荡1.0 min；15 000 r·min-1高速离心8.0 min，取上清1 000 μL进样分析。

2.4 专属性试验分别将空白马血清、40 mg·L-1的替考拉宁中质量浓度质控品按2.3部分方法处理，按2.1部分色谱条件进样分析，记录色谱图，色谱图见图1。替考拉宁以11.50 min的色谱峰(替考拉宁TA2-2的色谱峰)计，血清内源性物质及其他杂质均不干扰样品的分离测定，结果表明该方法专属性好。

A为空白马血清；B为替考拉宁对照品；＊为替考拉宁TA2-2的色谱峰。

2.5 线性关系考察精密量取替考拉宁对照品贮备液适量，分别加入适量空白马血清，制成3.75、7.50、15.00、30.00、60.00、120.00 mg·L-1的替考拉宁系列混合标准血样，将制备好的系列混合标准血样按2.3部分方法处理，按2.1部分色谱条件进样分析，以峰面积Y对质量浓度X做线性回归方程：

Y=3 149.67X-1 738.91。

式中：Y为峰面积，单位为mV·min；X为质量浓度，单位为mg·L-1。

r=0.999 9，线性范围为3.75～120.00 mg·L-1。结果表明替考拉宁在3.75～120.00 mg·L-1范围内，线性良好。

2.6 精密度试验精密量取替考拉宁对照品贮备液适量，分别加入适量空白马血清，制成40.00 mg·L-1的替考拉宁中质量浓度质控血样，按2.3部分方法处理，按2.1部分色谱条件进样分析，连续进样6次，考察仪器精密度。结果RSD为1.6%，表明该方法精密度良好。

2.7 回收率试验按2.2.2部分制备10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉宁低、中、高质量浓度质控血样，每个水平的质控样品平行制备3份样品，按2.3部分方法处理后进样分析，考察方法回收率。结果低、中、高质控的回收率分别为98.9%，98.2%，98.0%，表明该方法回收率良好。

2.8 稳定性试验按2.2.2部分制备10.00、40.00、80.00 mg·L-1的替考拉宁低、中、高质控血样，每个水平的质控制备6份样品，分别考察室温下24 h以及-30 ℃冰箱保存30 d的稳定性，结果在两个条件下保存后，质控血样中替考拉宁的含量变化均小于5%，稳定性试验结果表明替考拉宁在血清中稳定性良好。

2.9 临床应用收集河南省人民医院2020年1月至2020年3月在重症监护室住院患者的血样，进行替考拉宁血药浓度监测，共检测11例。参考《治疗药物监测临床应用手册》[4]中推荐监测替考拉宁稳态谷浓度>10 mg·L-1，检测结果中有5例样本替考拉宁的血药浓度高于10 mg·L-1，达到目标血药浓度的样本量仅占总样本量的45.45%。以上结果分析显示，达到临床有效血药浓度者不足一半，临床上应给予重视。在使用替考拉宁进行治疗时，医生应及时监测替考拉宁血药浓度，进而促进合理用药。

3 讨论

目前，国内开展替考拉宁治疗药物监测的工作还处于起步阶段，查阅相关文献发现临床工作中测定替考拉宁血药浓度的方法主要有高效液相色谱法[5-10]和液相色谱-质谱法[11-15]，血样的预处理方法多采用乙腈沉淀蛋白及二氯甲烷或三氯甲烷萃取，该处理方法操作繁琐并且耗时较长，不适于批量处理。并且这类方法在前处理时用到的乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷等有机试剂毒性较大，日常使用时会对工作人员造成一定伤害，所以该方法并不适合临床大批量的检测。有研究在血样处理时采用了Centrifree超滤装置，该装置可以截留分子量>30 000的物质，但是整个处理过程需要在37 ℃水浴中平衡30 min，然后在37 ℃，1 500×g下离心 30 min，样品前处理耗时较长，所以处理过程虽然相对沉淀蛋白的方法较安全，但是整个处理过程相对繁琐[11]。本研究中，前处理方法用时约10 min，并且相对安全，操作简单、方便，适于批量处理。另外液相色谱-质谱法对实验室以及操作人员的专业要求较高，该方法不适于在基层医院开展。

本研究建立的全自动二维液相色谱测定替考拉宁血药浓度的方法具有前处理简单、测定快速、灵敏度高、准确性好、稳定性强等特点，能满足临床报告对及时性、准确性和测定范围的要求，可以作为临床监测血药浓度的有效方法。