高效液相色谱柱后衍生法测定大黄䗪虫丸中的黄曲霉毒素

贺敏才，卢向红，袁邦群

(娄底市食品药品检验检测所，湖南娄底 417000)

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株产生的一类致癌物质，可诱发肝、肾、肺、胃、结肠等部位的癌变，是目前为止发现的毒性最大的真菌毒素。黄曲霉毒素可以通过多种途径污染食品和饲料，直接或间接地进入食物链，从而威胁人们的健康和生命安全。目前有100多个国家已经制订了食品中黄曲霉的法规标准及检测方法，我国也已于2011年4月20日发布了《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2011），其规定了食品中黄曲霉毒素的限量指标。《中国药典》2005年版增补本收载了黄曲霉毒素的测定方法，并规定了部分品种的限量值[1]。

大黄䗪虫丸是由熟大黄、土鳖虫、水蛭、虻虫、桃仁、炒苦杏仁、黄芩、地黄、白芍、甘草等十二味药经粉碎、过筛和混匀制成的复方制剂。其功效是活血破瘀，通经消癥。常用于瘀血内停所致的癥瘕、闭经，症见腹部肿块、肌肤甲错、面色黯黑、潮热羸瘦、经闭不行[2]。《中国药典》2020年版一部对其中的土鳖虫、水蛭、桃仁的黄曲霉毒素进行了限量控制[2]。目前对大黄䗪虫丸安全性方面的研究尚未见报道，为进一步保证药品的安全性，本试验参照《中国药典》2020年版四部通则2351及有关文献资料[3-9],采用高效液相色谱法柱后衍生法，对大黄䗪虫丸中黄曲霉毒素进行检测，以了解大黄䗪虫丸中黄曲霉毒素污染状况，并为临床安全用药提供数据资料。

1 仪器与方法

1.1 仪器

Waters e2695高效液相谱仪（带自动进样器、柱温箱、2475荧光检测器、Empower3工作站）；梅特勒-托利多XS303S电子分析天平（千分之一）；光化学衍生器Huirentek PHRED-HR；高速匀质机D-500（Made by Wiggens）；离心机TG16G（湖南凯达科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

免疫亲和柱（ROMER，AflaStarTM R，Lot：1000004945）；黄曲霉毒素混合标准品溶液（中国食品药品检定研究院610001-201602）；甲醇、乙腈均为色谱纯；Ⅰ级纯化水（自制）；其他试剂均为分析纯。大黄䗪虫丸（批号为20170908、20171112、20171217、20180503、20180810、20181109、20190505、20191202、20191211、20200610，由某制药公司生产）。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Intersil ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相为甲醇-水，梯度洗脱（比例见表1），流速为1.0 mL/min；柱后衍生-光化学衍生法；荧光检测器，激发波长360 nm，发射波长450 nm，进样量20 μL。

表1 HPLC梯度洗脱表

1.3.2 溶液制备

（1）混合对照品溶液制备。取黄曲霉毒素混合标准品溶液（黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.02 μg/mL、0.43 μg/mL、1.06 μg/mL、0.38 μg/mL）1.00 mL，加甲醇稀释至50.00 mL，作为储备液，量取储备液1.00 mL，加甲醇稀释至10.00 mL。

（2）供试品溶液制备。取供试品粉末15 g，置均质瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌2 min（搅拌速度大于11 000 r/min），离心5 min（离心速度4 000 r/min），精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，离心5 min（离心速度4 000 r/min），取上清液20.00 mL，通过免疫亲和柱，流速3 mL/min，用20 mL水洗脱，弃去洗脱液，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再加2.00 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇稀释至2.00 mL，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取滤液备用。

（3）阴性样品溶液制备。取检测无黄曲霉毒素的药材，按照药典制法制成大黄䗪虫丸样品，取样品15 g，同供试品方法制备，即得。

2 结果与分析

2.1 系统适应性试验

按照1.3.1的色谱条件，分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图（见图1）。由图1可知，黄曲霉毒素各组分完全分离（分离度大于1.5），阴性样品无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 线性相关性考察

按照1.3.1的色谱条件，精密吸取1.3.2（1）的黄曲霉毒素混合对照品溶液 5 μL、10 μL、15 μL、20 μL 和 25 μL 进行测定，记录色谱图，以对照品量为横坐标（X,pg），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表2

表2 回归方程及线性范围

2.2.2 精密度试验

按照1.3.1的色谱条件，吸取混合对照品溶液15 μL，进样6次，测定峰面积，结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分别为2.43%，1.86%，2.99%，2.05%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 稳定性试验

取供试品溶液（批号20191202）1.0mL，加入混合对照品溶液0.10 mL，分别制备2 h、4 h、6 h、12 h、16 h和24 h后，按照1.3.1的色谱条件进行测定，结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的RSD分别为2.03%，1.98%，2.69%，2.32%，表明供试品溶液在24 h内测定稳定。

2.2.4 重复性试验

取样品（批号20180810），按1.3.2（2）的方法，制备6份供试品溶液，按照1.3.1的色谱条件进行测定。结果表明，黄曲霉素B1的RSD为3.02%，黄曲霉毒素总量的RSD为4.12%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验

精密称取未检出黄曲霉毒素的样品约7.5 g（批号20181109），6份，分别加入1.3.2（1）的黄曲霉毒素混合对照品溶液储备液0.10 mL，按照1.3.2（2）的方法制备，按照1.3.1的色谱条件进行测定，计算黄曲霉毒素的RSD和回收率。结果表明，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均回收率分别为94%，86%，89%，83%；RSD分别为1.89%,1.56%，2.11%，2.03%（n=6）。

2.2.6 检测限和定量限试验

倍比稀释混合对照品溶液，在信噪比约为3时，测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限分别为0.408 pg，0.172 pg，0.424 pg，0.152 pg；在信噪比约为10时，测得黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量限分别为1.346 pg，0.585 pg，1.421 pg，0.519 pg。

2.2.7 样品含量测定

取10批次样品，按照1.3.2（2）的方法制备供试品溶液，按照1.3.1的色谱条件进行测定，结果见表3。

表3 样品测定结果（n=2）

3 结论

①本试验中，曾按《中国药典》一部方法选用甲醇-乙腈-水（40∶1842）作为流动相，分离效果不理性，样品中其他成分干扰大，最后选用甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，各黄曲霉毒素峰分离效果好，其他成分无干扰。②对10批次样品进行检测，其中有9批中有黄曲霉毒素的检出，结果黄曲霉毒素B1的含量均少于1 μg/kg，黄曲霉毒素的总量均小于2 μg/kg，都低于药典规定的限度值（5 μg/kg，10 μg/kg）。表明大黄䗪虫丸安全性较好，但检出率高到90%，仍应重视黄曲霉毒素的检测。③本方法具有专属性强，操作简单，结果稳定可靠，分离度好等特点，可作为用于大黄䗪虫丸中黄曲霉毒素的含量测定的方法。④大黄䗪虫丸中的熟大黄、桃仁、炒苦杏仁、甘草等及主要辅料蜂蜜，有的属于药食同源，有的可用于保健食品。而本次试验中黄曲霉毒素的检出率极高，相关部门应反思其原料的安全性，尤其上述广泛作为食品使用的药材，进而保证广大消费者的饮食用药安全。