基于UPLC-Q/TOF-MS的痹祺胶囊化学物质组及入血成分的研究

刘建庭，仉 瑜，卜睿臻，赵鸿鹏，赵 宇，张洪兵，许 浚，张铁军，王 磊*，刘昌孝*

1.天津药物研究院 释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津 300462

2.天津药物研究院 天津市中药质量标志物重点实验室，天津 300193

3.天津中医药大学，天津 301617

4.天津达仁堂京万红药业有限公司，天津 300112

风湿、类风湿性疾病、关节炎属于慢性病，在传统医学中属于痹症，传统观念中痹症的产生是由“皆因体虚，腠理空虚，受风寒湿气而成”，故治疗以益气养血、祛风除湿、散寒通络和活血止痛为治疗原则[1]。痹祺胶囊来源于汉代名医华佗的“一粒仙丹”，由马钱子粉、党参、白术、茯苓、丹参、三七、川芎、牛膝、地龙与甘草10味药组成，具有益气养血、祛风除湿、活血止痛的功效。其中马钱子粉为君药，起通痹消痛之功效；党参、白术、茯苓与丹参为臣药，党参补血益气，白术祛风寒湿痹，茯苓健脾益气，丹参养血和血；三七、川芎、牛膝、地龙为佐药，其中三七止血化瘀、消肿止痛，川芎活血行气、祛风止痛，牛膝、地龙活血化瘀、通络止痛；甘草为使药，调和诸药之功效，充分体现君臣佐使的处方原则[2-3]。现代药理研究已证明痹祺胶囊具有镇痛抗炎作用，临床上用于治疗风湿、类风湿性关节炎和腰椎间盘突出等症[4]。为进一步阐明痹祺胶囊组方的科学性及药效成分，本实验采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术（UPLC-Q/TOF-MS）技术，对痹祺胶囊及其入血成分进行了研究，以确定痹祺胶囊的药效物质基础，为痹祺胶囊的后续研究提供理论基础。

1 材料与仪器

1.1 仪器

Acquity UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Xevo G2 Q-TOF高分辨质谱（美国Waters公司）；AB204-N电子天平（德国Meteler公司）；BT25S电子天平（德国 Sartorius公司）；超声波清洗仪（宁波新芝生物科技公司）；VORTEX-5旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造公司）。

1.2 试剂与材料

对照品士的宁（批号110705-200306）、马钱子碱（批号110706-200505）、人参皂苷Rb1（批号110704-201827）、人参皂苷Rd（批号111818- 201603）、人参皂苷Re（批号110754-202028）、人参皂苷Rg1（批号110703-201731）、三七皂苷R1（批号110745-201921）、阿魏酸（批号110773-200611）、蜕皮甾酮（批号111638-200402）均购自中国食品药品检定研究院；对照品甘草次酸（批号MUST- 16032217）、丹酚酸B（批号MUST-17040503）、丹参酮IIA（批号MUST-17101811）、迷迭香酸（批号MUST-18053110）、丹参素（批号MUST-18060920）、茯苓酸（批号MUST-18072910）、Z-藁本内酯（批号MUST-19041005）均购自成都曼斯特生物科技；对照品白术内酯II（批号M22A10S95762）、白术内酯III（批号M13D10S105676）、党参炔苷（批号P13M11L112809）、洋川芎内酯 I（批号P27A11F122339）、甘草酸（批号Y02J11L113432）、去氢土莫酸（批号Z27M10S89331）均购自上海源叶生物科技有限公司；所有对照品质量分数均＞95%。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，购自天津康科德科技有限公司；纯净水购自杭州娃哈哈饮用水有限公司；痹祺胶囊（批号311574）由天津达仁堂京万红药业有限公司提供。

雄性SD大鼠，SPF级，体质量（200±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。动物伦理批准单位天津天诚新药评价有限公司（动物伦理批准号 2021031901）。

2 方法

2.1 动物实验

取痹祺胶囊内容物适量，加入0.3%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）混匀制成质量浓度为0.3 g/mL混悬液，作为痹祺胶囊大鼠ig溶液。

雄性SD大鼠，饲养于室温25 ℃、湿度50%、12 h昼夜交替的环境，自由采食、饮水饲养适应1周。实验前禁食12 h，但不禁水，随机分为2组并称定体质量，空白对照组按10 mL/kg ig给予0.3% CMC-Na溶液，痹祺胶囊给药组按10 mL/kg的剂量ig痹祺胶囊溶液。给药1、2和4 h后，以10%水合氯醛麻醉，肝门静脉取血置于肝素化试管中，在3000 r/min离心10 min分离血浆，置-20 ℃冰箱中保存，备用。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品士的宁、马钱子碱、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、三七皂苷R1、茯苓酸、去氢土莫酸、洋川芎内酯I、藁本内酯、阿魏酸、丹参素、丹酚酸B、丹参酮IIA、甘草酸、迷迭香酸、甘草次酸、白术内酯II、白术内酯III、党参炔苷、蜕皮甾酮适量，加甲醇溶解制备成各质量浓度约为10 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 体外样品的制备 取痹祺胶囊内容物0.30 g，精密称定，置于5 mL量瓶中，加入75%甲醇，密塞，超声处理40 min，放冷，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，续滤液供UPLC-Q/TOF-MS检测分析。

2.2.3 血浆样品的制备 取给药后各时间点血浆样品等体积混匀，取600 μL置于EP管中，加入4倍量甲醇，涡旋1 min混匀沉淀蛋白，于4 ℃条件下13 000 r/min离心10 min，上清液4 ℃下N2吹干，残渣以150 μL 75%甲醇涡旋1 min复溶，13 000 r/min离心10 min，吸取上清液供UPLC-Q/TOF-MS检测分析。空白血浆进行同样操作。

2.3 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）-含0.1%甲酸的水溶液（B）；体积流量0.2 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL；梯度洗脱：0～4 min，5%～14%A；4～11 min，14%～23%A；11～18 min，23%A；18～21 min，23%～30%A；21～27 min，30%～40%A；27～29 min，40%～50%A，29～40 min，50%～55%A；40～50 min，55%～95%A；50～55 min，95%A。

2.4 质谱条件

质谱分析采用Waters Xevo G2 Q-Tof高分辨质谱，配备电喷雾离子源（ESI），毛细管电压，正离子模式为3.0 kV，负离子模式为2 kV。离子源温度110 ℃，样品锥孔电压30V，锥孔气体积流量50 L/h，氮气脱气温度350 ℃，脱气体积流量800 L/h，扫描范围m/z50～2000，内参校准液亮氨酸脑啡肽用于分子量实时校正。

2.5 数据库的建立

针对痹祺胶囊是含有10味中药的复方，成分复杂，通过查阅数据库的文献，针对全方及各单味药的化学成分进行了总结，将各单味药的成分进行汇总，包括分子式、分子结构式、相对分子质量、分子离子、药材来源、中英文名称等。建立1个专属于痹祺胶囊的数据库，对UPLC-Q/TOF-MS采集的数据进行对比分析，快速鉴定出已知化合物。

3 结果

采用“2.3”“2.4”项的UPLC-Q/TOF-MS条件，对痹祺胶囊、大鼠空白血浆及给药血浆样品进行检测分析。正、负离子模式下，痹祺胶囊制剂、大鼠空白血浆和给药大鼠血浆样品的基峰色谱图（BPI）如图1、2所示。

图1 正离子模式下BPI色谱图Fig.1 BPI chromatogram in positive ion mode

图2 负离子模式下BPI色谱图Fig.2 BPI chromatogram in negative ion mode

在痹祺胶囊样品中共鉴定出280个化学成分，其中来源于马钱子的有17个、党参的有7个、白术的有11个、茯苓的有21个、丹参的有53个、三七的有41个、川芎的有39个、牛膝的有22个、地龙的有17个及甘草的有59个。UPLC-Q/TOF-MS数据见表1，TOF-MS的测得值与理论值比较，精确质量数的误差均小于1×10-5。在已鉴定的化合物中，22个经与对照品比对保留时间、质谱数据，得到进一步确证。

马钱子中的主要有效成分是生物碱类化合物[5-6]，以马钱子碱与士的宁为例，马钱子碱的准分子离子 [M＋H]+m/z395.19容易丢失C4H9N，产生m/z324.12的碎片离子，或连续丢失C2H4与NH3，分别产生m/z367.16和m/z350.13的碎片离子。士的宁的准分子离子为 [M＋H]+m/z335.17，丢失C2H4产生m/z307.14的碎片离子，继续丢失C2H5N与C5H4O而分别产生m/z264.10和m/z184.07的碎片离子。裂解途径见图3和4。

表1 痹祺胶囊LC-MS数据Table 1 LC-MS data of Biqi Capsule

续表1

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炔苷是党参中主要的化学成分[7-8]，在质谱中形成 [M＋HCOO]-m/z441.179 3的准分子离子，丢失糖基后形成m/z215.10的碎片离子，继续丢失末尾的CH2O，产生m/z185.09的碎片离子，或是丢失炔基侧的长链和糖基，产生m/z143.07的碎片离子，再丢失H2O形成m/z125.06的碎片离子。裂解途径见图5。

白术内酯III是白术的活性成分[9-10]，在质谱中显示 [M＋H]+m/z249.145 7的准分子离子，丢失H2O形成m/z231.13的碎片离子，分别发生完全或不完全环断裂，产生m/z163.07和m/z189.09的碎片离子，在发生内酯环上酯键断裂，产生m/z203.14和m/z119.08的碎片离子。裂解途径见图6。

图3 马钱子碱质谱裂解途径Fig.3 Fragmentation pathways of brucine by mass spectrometry

图4 士的宁质谱裂解途径Fig.4 Fragmentation pathways of strychnine by mass spectrometry

图5 党参炔苷质谱裂解途径Fig.5 Fragmentation pathways of lobetyolin by mass spectrometry

图6 白术内酯III质谱裂解途径Fig.6 Fragmentation pathways of atractylodes III by mass spectrometry

茯苓酸是茯苓的特征性成分[11-12]，在质谱中显示 [M－H]-m/z527.37的准分子离子，易脱去H2O与CO2形成m/z465.33的碎片离子，进一步失去CH3COOH形成m/z405.31的碎片离子。裂解途径见图7。

丹参的化学成分主要包括二萜醌类和丹酚酸类成分[13-16]。丹参酮IIA在质谱中分子离子 [M＋H]+m/z295.13连续丢失H2O和CO形成m/z277.12和m/z249.12的碎片离子，再分别裂解失去CH3产生m/z262.09和m/z234.10的碎片离子。丹酚酸B的准分子离子 [M－H]-m/z717.14丢失丹参素，产生m/z519.09的碎片离子，丢失咖啡酸与丹参素，产生m/z339.05的碎片离子。此外，还容易丢失H2O、CO2及CO等产生一系列碎片离子。裂解途径见图8和9。

图7 茯苓酸质谱裂解途径Fig.7 Fragmentation pathways of pachymic acid by mass spectrometry

图8 丹参酮IIA质谱裂解途径Fig.8 Fragmentation pathways of tanshinone IIA by mass spectrometry

图9 丹酚酸B质谱裂解途径Fig.9 Fragmentation pathways of salvianolic acid B by mass spectrometry

三七含有大量皂苷类成分，以三七皂苷R1为例[17]，准分子离子 [M－H]-m/z931.52脱去木糖产生[M－H－xyl]-m/z799.48的碎片离子，再连续脱去葡萄糖分别产生 [M－H－xyl－glc]-m/z637.42、[M－H－xyl－glc－glc]-m/z475.37的碎片离子。裂解方式见图10。

川芎的化学成分分为2大类，有机酸类和苯酞类成分[18-19]。以阿魏酸为例，准分子离子为 [MH]-m/z193.050 1，易于丢失甲基形成m/z178.02的碎片离子，发生羧基断裂丢失CO2形成m/z134.03和m/z149.05的特征碎片离子。藁本内酯是川芎中含量较高的苯酞类成分，准分子离子 [M＋H]+m/z191.106 4丢失H2O、CO后，形成m/z173.09和m/z145.10的碎片离子，进而丢失侧链上的C2H4，形成m/z117.06的碎片离子。裂解方式见图11和12。

牛膝中主要含有以齐墩果酸为苷元的皂苷类成分[20-21]，以牛膝皂苷C为例，在质谱中显示 [MH]-m/z953.440 2的准分子离子，丢失3位糖基末尾上的支链，形成m/z835.44的碎片离子，分别丢失28位的葡萄糖或者继续丢失3位糖基上的支链，产生m/z793.43和m/z673.39的碎片离子，最终产生m/z455.35的齐墩果酸母核的特征碎片离子。此外，甾酮类成分是牛膝中另一类活性成分，结构类型主要为四环三萜类。以蜕皮甾酮为例，在质谱中显示 [M＋HCOO]-m/z525.308 1的准分子离子，其 [MH]-m/z479.30丢失20位的侧链，形成m/z319.19的碎片离子，失去H2O后产生m/z301.01的碎片离子。裂解方式见图13和14。

图10 三七皂苷R1质谱裂解途径Fig.10 Fragmentation pathways of notoginsenoside R1 by mass spectrometry

图11 阿魏酸质谱裂解方式Fig.11 Fragmentation pathways of ferulic acid by mass spectrometry

图12 藁本内酯质谱裂解方式Fig.12 Fragmentation pathways of ligustilide by mass spectrometry

图13 牛膝皂苷C质谱裂解途径Fig.13 Fragmentation pathways of achyranthoside C by mass spectrometry

图14 蜕皮甾酮质谱裂解途径Fig.14 Fragmentation pathways of ecdysterone by mass spectrometry

甘草中黄酮类成分种类丰富，包括查耳酮类、二氢黄酮类黄酮及黄酮醇类等，多以糖苷形成出现[22-24]。以甘草苷为例，在质谱中显示 [M－H]-m/z417.118 6的准分子离子，二级谱图中主要出现脱去葡萄糖基的碎片离子m/z255.06，C环上发生RDA裂解得到的m/z135.01的特征碎片，进一步丢失O形成m/z119.08的碎片离子。三萜类成分是甘草化学成分的重要组成部分，主要为甘草酸类衍生物，以甘草酸为例，在质谱中显示 [M＋H]+m/z823.411 4的准分子离子，易脱去葡萄糖醛酸得到m/z647.38的碎片离子，失去2个葡萄糖醛酸得到m/z471.34的碎片离子，再进一步失去H2O，得到m/z453.33碎片离子。裂解方式见图15和16。

通过比对分析痹祺胶囊制剂、血浆样品的数据，同时存在于痹祺胶囊制剂与给药血浆样品中的离子，被认为是潜在的以原型形式吸收的药物成分。结合痹祺胶囊制剂所含化学成分研究结果，分析质谱裂解规律，在给予痹祺胶囊的大鼠血浆中共鉴定得到59个吸收原型成分，通过筛选仅在给药血浆样品中出现的离子信号，最终在大鼠血浆中共鉴定得到22个代谢物，代谢途径主要为还原、羟基化、甲基化、葡萄糖醛酸结合和硫酸酯共价结合。其UPLC-Q/TOF-MS数据见表2。以M1、M2、M13等为例说明代谢物解析过程。

图15 甘草苷质谱裂解途径Fig.15 Fragmentation pathways of liquiritin by mass spectrometry

图16 甘草酸质谱裂解途径Fig.16 Fragmentation pathways of glycyrrhizic acid by mass spectrometry

M1在质谱图中显示出准分子离子 [M＋H]+m/z351.171 5，确定分子式为C21H22N2O3，比士的 宁的准分子离子多16（O），二级质谱中可见m/z184.07和m/z156.07的碎片离子，与士的宁的裂解方式相同，推测M1为士的宁的羟基化代谢产物。

M2的保留时间为5.52 min，在质谱中显示准分子离子为 [M－H]-m/z273.006 9，确定分子式为C10H10O7S，碎片离子m/z193.05为m/z273.006 9丢失SO3而形成，且与阿魏酸准分子离子相同，提示可能经过硫酸酯结合代谢途径，碎片离子m/z178.02、m/z160.08与阿魏酸质谱信息一致，初步鉴定M2为阿魏酸的硫酸酯结合物。

M13在质谱图中显示出准分子离子 [M－H]-m/z207.101 6，确定分子式为C12H16O3，比6,7-环氧藁本内酯的准分子离子多2（H2），二级质谱中可见m/z205.08和m/z163.11的碎片离子，推测M13为6,7-环氧藁本内酯的还原产物。M4、M5的保留时间分别为8.83 min和9.11 min，在质谱中显示准分子离子为 [M＋H]+m/z433.11，确定分子式为C21H20O10，比甘草素的准分子离子多176，提示可能经过葡萄糖醛酸结合代谢途径，并且二级质谱中可见m/z257.08和m/z137.02的碎片离子，这与甘草素的质谱信息相同，推测M4、M5为甘草素的葡萄糖醛酸结合物。

4 讨论

中药经历现代制药工艺过程的物质传递与化学变化，最终以复方制剂的形式通过药物体内传输发挥临床疗效，其功效是化学物质基础经过质量传递和代谢转化后生物效应的综合体现。因此，从中药的有效性角度认识和评价其质量，必须明确“药材成分组-制剂成分组-血行成分组”的传递-转化过程，能为中药药效物质基础的传递过程提供清晰的路径，是质量标志物发现及确定的重要依据[17]。

本实验运用UPLC-Q/TOF-MS技术方法，优化液相色谱、质谱分离检测条件，分析痹祺胶囊所含化学成分，经与对照品和文献数据比对，分析其质谱裂解规律，在痹祺胶囊样品溶液中共鉴定得到280个化学成分，化合物种类复杂多样，通过与原料药材指纹谱比较，分析制剂化学成分归属，来源于马钱子粉的17个主要为生物碱类成分、党参的7个主要为炔苷类和脂肪酸类成分、白术的11个主要为内酯类成分、茯苓的21个主要为三萜酸类成分、丹参的53个主要为丹酚酸类和二萜醌类成分、三七的41个主要为皂苷类成分、川芎的39个主要为酚酸类和苯酞类成分、牛膝的22个主要为三萜皂苷类和甾酮类成分、地龙的17个主要为核苷类和有机酸类成分，以及甘草的59个主要为黄酮类和三萜类成分。

在制剂物质基础研究的基础上，进一步建立给药血浆的血行指纹谱，通过比对痹祺胶囊制剂、大鼠给药血浆及空白血浆样品的色谱图，筛选分析血

表2 痹祺胶囊大鼠血浆原型成分和代谢物LC-MS数据Table 2 LC-MS data of prototype components and metabolites of Biqi Capsule in rat plasma

续表2

中移行的原型药物成分及代谢物，结果在大鼠血浆中共鉴定得到81个痹祺胶囊相关的外源性化合物，包括59个吸收原型药物成分和22个代谢产物，代谢途径主要为羟基化、还原、甲基化、葡萄糖醛酸结合和硫酸酯共价结合，它们可能是复方潜在的真正活性成分并与药理作用直接相关，为痹祺胶囊的深入分子作用机制研究及全面质量控制奠定了基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突