生物样品中醇类代谢物的化学衍生化质谱分析方法研究进展

曹宇奇，陆颖洁,2，郭寅龙

(1.中国科学院上海有机化学研究所，金属有机国家重点实验室，上海 200032；2.上海中医药大学交叉科学研究院，上海 201203 )

生物样品成分复杂，包含多种代谢物，如何对这些痕量级的代谢物进行高选择性和高灵敏度的分析是很多研究领域的热点问题[1]。质谱具有高灵敏度、高通量和较少的样品前处理等优势，被越来越多地用于痕量生物样品检测[2]。在质谱分析中，代谢物分子的离子化对于检测效率至关重要。然而，目前对于生物样品中诸多类型的代谢物仍然缺乏合适的离子化方法，导致其质谱离子化效率较差，难以进行定性和定量检测。

化学衍生化是通过特殊设计的化学衍生化试剂与样本中含有特定官能团的目标分子发生衍生化反应，对待测物质的某个官能团进行结构修饰，在保证其骨架结构基本不发生改变的情况下，使其理化性质发生改变，从而达到改变目标分子质谱行为的目的[3]。对待测样品进行化学衍生化一般有以下几个目的：1) 提高选择性和分离度[4-7]；2) 提高电离效率[8-10]；3) 改善目标分子的化学结构[11-14]；4) 消除内源性物质的干扰[15]；5) 促进同分异构体的分辨[16-18]，示于图1。发展至今，化学衍生化已经被证明能够大幅改善质谱仪对特定类型代谢物的检测能力。

图1 目标化合物与衍生化试剂的一般反应机理及衍生化方法的优点Fig.1 General reaction mechanism between target compound and derivatization reagent, and the advantages of derivatization methods

醇类代谢物主要是指化学结构中含羟基的内源性代谢物，主要包括脂肪醇、甘油酯、类固醇激素、糖类化合物、鞘氨醇、酚类等，广泛存在于各种生物样本中。这些醇类代谢物有较高的生理学活性，在生物体中承担着各种不同的生物学功能。例如，体内的脂肪醇主要来源于脂肪酸的还原代谢，脂肪醇、脂肪醛和脂肪酸的相互转化构成重要的代谢循环[19-20]。诸多疾病的发生发展与脂肪醇的代谢异常存在联系。例如，在医学上存在一些先天性的脂肪醇代谢障碍病例，如Sjögren-Larsson综合征(脂肪醇到脂肪酸的代谢过程缺失)[21]、Zellweger Syndrome肝脑综合征[22]。这些疾病主要是与脂肪醇代谢相关的基因缺陷所导致的遗传性疾病[23]。另外，有研究表明，脂肪醇在正常细胞和肿瘤细胞中的代谢水平存在差异，如MCF-7乳腺癌细胞中的脂肪醇水平比普通乳腺细胞高4倍，这为脂肪醇类物质发展为肿瘤生物标志物提供了有力依据[24]。

除脂肪醇外，甾醇和甘油酯类代谢物也有较强的生理学研究意义。甾醇主要包含脂肪醇和类固醇激素[25-27]。胆固醇是哺乳动物体内含量最丰富的甾醇，在细胞膜的构成和激素的生物合成过程中扮演着重要角色[26, 28-29]。体内的胆固醇含量变化与阿尔兹海默症、冠心病等多种疾病存在关联。类固醇激素具有极重要的医药价值，其在生命维持、性功能调节以及免疫调控的生理学作用已被多项研究结果所支持。甘油酯类物质在生物样品中占比较大，但目前研究较少[30]。甘油三酯是体内含量最大的甘油酯类代谢物，其通过酶降解生成甘油二酯和甘油一酯[31-32]。大量研究表明，甘油二酯在细胞信号传导过程中扮演着第二信使的角色[33]。甘油一酯被认为是一类重要的细胞信号分子[34]。

虽然醇类代谢物具有较高的生理学和药理学价值，但其在各种生物样品中的存在形式、存在种类以及含量水平等相关研究相对匮乏。相比其他类型代谢物，如醛类[35-36]、胺类[37-38]以及羧酸类[39-40]等，目前能够灵敏且高通量地定性和定量分析醇类代谢物的质谱方法仍然较少，严重阻碍了深入研究相关醇类代谢物在生物体内承担各项功能以及其代谢异常产生的生物学影响。在质谱中直接对生物样品中的醇类代谢物进行检测面临较低的离子化效率和较高的背景基质干扰2大困难。醇类代谢物一般趋于中性，质子亲和能较高，在常用的质谱离子源(如电喷雾离子源(ESI)以及基质辅助激光解吸附离子源(MALDI))中难以获得较好的离子化效率。另外，多种醇类代谢物(如脂肪醇和类固醇类激素)在生物样品中的含量极低，其质谱信号很容易被样品中其他类型的高丰度代谢物所掩盖。

综上，对醇类代谢物进行化学衍生化后，再进行质谱分析检测是一种新选择。相比于氨基、羧基和羰基等，醇类代谢物共有的羟基基团化学活性并不突出，因此，样品中部分低丰度的醇类代谢物对衍生化试剂的反应效率提出了较高要求。这些问题给醇类代谢物的衍生化试剂的设计增加了许多挑战。在科研工作者的不懈努力下，一系列性能优异的羟基衍生化试剂相继被报道，如硅烷化反应试剂[41-43]、酰氯/磺酰氯试剂[9, 44-49]，酸酐试剂[50]、N-烷基吡啶季铵化试剂[25, 51-56]、Py+试剂[57-60]等。这些试剂均有其各自的特点，并且已经应用于各种醇类代谢物的定性和定量分析中。从质谱仪器角度，针对GC-MS、LC-MS/MS、MALDI-MS等开发了不同的衍生化试剂和相应的质谱分析方法，以满足不同生物样品中醇类代谢物的检测分析需求。近年来，敞开式质谱离子源因其高通量、操作简便等优势得以快速发展，并应用于多种内源性代谢物的检测分析。质谱成像技术可以给出生物组织样品表面内源性代谢物的准确分布信息，引起了研究人员的广泛兴趣。开发能够在组织原位对醇类代谢物进行衍生化的衍生化试剂已成为一个新兴的研究领域。

本综述将主要介绍近期报道的各种醇类代谢物的化学衍生化试剂，详尽描述各类型试剂的优点和缺陷。另外，讨论这些衍生化试剂的应用价值及其发展趋势，希望给醇类代谢物的质谱分析方法开发、醇类代谢组学研究提供帮助。

1 醇类物质衍生化试剂

1.1 硅烷化试剂[41-43]

硅烷化试剂是较早被开发应用于醇类代谢物质谱分析的衍生化试剂，该类试剂已经成为使用GC-MS对醇类代谢物进行定性定量分析的主要手段。一般来说，醇类代谢物(如甾醇和糖类)本身(未被衍生化)在GC-MS中有一定的质谱信号，然而，大多极性较低且沸点较高，使其较难汽化并且难以在气相色谱中分离，这使得带有较强背景信号干扰的生物样品中醇类代谢物的分析工作难以开展。在硅烷衍生化反应中，硅烷化试剂通过靶向羟基的α-C发生Sn2型亲核取代反应，将硅烷基团加载至代谢物化学结构中，衍生化产物在GC-MS中的色谱分离行为和质谱信号均得到显著改善。另外，硅烷化反应一般不需要复杂的反应后处理和纯化步骤，可以直接注射到气相色谱。目前，常用的醇类代谢物硅烷化试剂包括N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)，N,O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)和N-(叔丁二甲基硅基)-N-甲基三氟乙酰酰胺(MTBSTFA)，结构示于图2。

注：a.MSTFA;b.BSTFA;c.MTBSTFA图2 常用的3种硅烷化试剂的化学结构Fig.2 Chemical structures of the commonly used silylation reagents

1.2 N-烷基吡啶季铵化(NAPQ)试剂[25,51-52,55-56]

本课题组提出了N-烷基吡啶季铵化试剂，并应用于脂肪醇和甾醇的衍生化。与大多数季胺化衍生化试剂不同，该衍生化试剂使用无季胺基团的吡啶试剂，通过季胺化反应将季胺基团引入醇类代谢物的化学结构中。在整个衍生化反应过程中，衍生化试剂和反应代谢物均不带电荷，仅最终生成的衍生化产物带有电荷。过量的衍生化试剂吡啶由于其离子化效率与衍生化产物相差悬殊，不会对质谱检测过程造成严重干扰，从而解决了许多季胺化试剂在衍生化完成后过量试剂对质谱检测形成干扰这一问题。同时，吡啶的稳定同位素试剂氘代吡啶易于获取，在衍生化实验中使用d0/d5-吡啶作为一对同位素标记的衍生化试剂，可以为衍生化产物的鉴别和定量工作带来便利。N-烷基吡啶季铵化反应的化学方程式示于图3。

图3 N-烷基吡啶季铵化反应方程式Fig.3 Chemical equation of N-alkylpyridinium quaternization

季胺化后的醇类代谢物极性大幅上升，且本身含有电荷，在ESI和MALDI离子源中都有较好的质谱响应。该衍生化反应快速、简便且衍生化试剂成本低廉，本课题组进一步将其应用于醇类代谢物的LC-MS、MALDI-MS以及敞开式质谱，拓宽了该衍生化反应的适用领域。具体应用将在后续章节详细介绍。

1.3 N-烷基吡啶氯季铵化(NCAPQ)试剂[53-54]

本课题组在N-烷基吡啶季铵化试剂的基础上，针对脂肪醇和脂肪醛的检测开发了N-烷基吡啶氯季铵化试剂。该试剂将三氟甲磺酸酐替换成氯化亚砜，在乙腈为溶剂的体系下，对脂肪醛检测的专一性较好，并生成脂肪醛的氯季铵化产物，由于天然同位素35Cl、37Cl的存在会使质谱图上出现质量数相差2 u的同位素峰对，便于衍生化产物的辨别。在二氯甲烷为溶剂的体系下，可用于同时检测脂肪醛和脂肪醇。此外，氯化亚砜是质子敏感型试剂，可与去离子水反应转化为盐酸和二氧化硫气体，能够通过气体分离的方法从溶液体系中去除。与NAPQ试剂相同，NCAPQ试剂也不带电荷，衍生化产物的电荷中心通过衍生化反应生成，所以过量的衍生化试剂不会影响后续的检测工作。N-烷基吡啶氯季铵化反应的化学方程式示于图4。

图4 N-烷基吡啶氯季铵化反应方程式Fig.4 Chemical equation of N-(1-Chloroalkyl)pyridinium quaternization

在NCAPQ衍生化试剂应用方面，除了与传统的LC-MS联用外，本课题组还将其与离子淌度质谱相结合，获得多一维的漂移时间数据，可以对生物样本中的化合物进行更快速的鉴别。

1.4 酰基化反应试剂(酰氯，酸酐，羧酸)[9,44-49]

酰基化反应试剂包含多种广泛应用的醇类代谢物化学衍生化试剂，其主要利用羟基与酰氯或酸酐发生酯化反应，将衍生化试剂分子加入醇类代谢物的化学结构中。为了使衍生化产物的质谱信号显著增强，一般会在衍生化试剂分子骨架中加入季胺基团。得益于羧酸、酰氯或酸酐配合酯化反应缩合剂的高反应活性，这类衍生化试剂对醇类代谢物的整体衍生化效率尚可。然而，正是由于其高反应活性，该类试剂的化学选择性较差，易与生物样品中含量较多的胺类物质发生反应，且反应过程激烈，副反应较多。同时，酰氯或酸酐类试剂对水十分敏感，存储要求较高。另外，由于许多衍生化试剂骨架中含有带电荷的季胺基团，反应后过量的衍生化试剂会对醇类代谢物的衍生化产物质谱检测造成干扰，需要通过特殊设计的反应后处理流程加以改进。

目前，常用的酰基化反应试剂主要包括用于GC-MS的五氟苯甲酰氯，用于LC-MS的N-氯化甜菜碱酰氯(N-chlorobetainyl chloride)、N,N-二甲基甘氨酸(DMG)等，其化学结构式示于图5。

1.5 Py+试剂[57-60]

2-氟-1-甲基吡啶鎓 (FMP) 对甲苯磺酸试剂可与伯醇、仲醇以及酚羟基反应形成烷基 1-甲基吡啶鎓醚离子，示于图6。由于其带有正电荷，因此非常适合使用ESI和MALDI离子源进行检测分析。该试剂的反应原理是一个简单的亲和取代反应，在室温下即可进行。在衍生化产物的二级质谱中可以观察到特征性的m/z110、m/z[M-109]、m/z[M-111]峰，便于衍生化产物的辨识和归纳。

注：a.五氟苯甲酰氯;b.N-氯化甜菜碱酰氯;c.N,N-二甲基甘氨酸图5 常用的3种酰基化试剂的化学结构Fig.5 Chemical structures of the commonly used acylation reagents

图6 2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯磺酸试剂反应方程式Fig.6 Chemical equation of 2-fluoro-1-methylpyridinium tosylate

目前，该试剂已广泛应用于表面活性剂、雌激素、丁丙诺啡、聚酰胺和甾醇的检测，并已拓展到质谱成像领域，对含酚羟基类目标化合物进行可视化分析，以揭示其在生物样本中的空间分布。

1.6 硼酸类试剂[61-62]

人体内存在一些特殊结构的醇类代谢物，其化学结构中存在相邻的羟基基团(如双酚或频哪醇)，比较典型的包括唾液酸、糖类、儿茶酚胺和甘油一酯。针对这类代谢物的化学衍生化可以采用特殊设计的硼酸类试剂。常用的硼酸类衍生化试剂在苯硼酸骨架上修饰质谱行为较好的叔胺或季胺基团后，通过硼酸与多元醇发生快速缩合反应完成衍生化。该类衍生化反应条件温和，反应速度快，效率较高，已经广泛应用于多元醇的定性定量分析以及质谱成像中。硼酸类试剂与多元醇的衍生化反应示于图7。

图7 硼酸类试剂衍生化反应示例Fig.7 Illustration of the derivatization reaction of boronic acid with biological molecules containing polyhydroxyl motifs

2 醇类代谢物化学衍生化试剂在质谱中的应用

2.1 气相色谱-质谱法

直接使用GC-MS分析醇类物质面临难以汽化、背景干扰较大等问题，研究人员开发了一系列硅烷化试剂和酰基化试剂来提高检测灵敏度。

2009年，Richard课题组使用硅烷化试剂BSTFA、MSTFA对甾醇类代谢物进行衍生化[42]，选用了13种常见的甾醇类物质，包括一些类固醇激素，采用微波技术对衍生化反应进行加速。通过对不同试剂的各微波反应参数进行优化调节，最终选定MSTFA作为衍生化试剂。在小于1 min的反应后，达到与传统加热法30 min相同的衍生化效果。

2011年，David课题组使用一种全氟酰基化试剂五福苯甲酰氯(PFBoylCl)对脂肪醇类物质进行化学衍生化，然后使用GC-MS进行分析[43]，衍生化反应的方程式示于图8。这项研究从3个方面对整个衍生化反应流程进行了改进。首先，优化了各醇类物质的衍生化反应时间和温度；然后使用微波技术作为另一种加热方式加速衍生化反应；最后，尝试增加一个衍生化反应后处理步骤，通过溶剂提取消除过量的衍生化试剂对后续衍生化产物检测分析的不利影响。最终确定的最优条件为60 ℃加热45 min。另外，微波技术可以显著加快反应速度，减少衍生化反应时间至3 min。通过比较几种用于反应后处理提取的溶剂，最终选定二氯甲烷作为最优的提取溶剂来提取衍生化产物，现已成功地将这一衍生化方法应用于提取的小鼠血清中脂肪醇和胆固醇的分析。

图8 PFBoylCl衍生化反应方程式Fig.8 Chemical derivatization equation of PFBoylCl

2.2 电喷雾离子源-质谱法

2.2.1常规衍生化ESI-MS/MS分析 通过化学衍生化可以在醇类代谢物分子骨架中加入有利于ESI离子化的基团，大幅提高衍生化产物的离子化效率。同时，很多醇类代谢物缺乏特征性的碎裂基团，在MS/MS质谱中难以找到较稳定的碎片离子。通过化学衍生化连上经过特殊设计的化学基团，可以显著改善其在MS/MS中的质谱行为，辅助找到多反应监测(MRM)定量离子对，为使用LC-ESI-MS/MS分析醇类代谢物提供帮助。

2001年，Gary课题组报道了使用2-氟-1-甲基吡啶鎓对甲苯磺酸试剂(Py+试剂)对一级和二级醇酚进行衍生化后ESI-MS分析[58-59]。Py+试剂中2位的F原子很容易被羟基取代，从而将醇类物质加载到吡啶鎓骨架中，该衍生化方法已应用于辣椒油和玫瑰精油中一级、二级醇的检测，同时用于丁香油中酚类物质的检测。衍生化产物无需清洗等后处理操作，直接使用ESI-MS/MS即可得到较好的分析结果，同时MS/MS中前体离子和中性丢失也确证了该方法的可靠性。该衍生化方法快速灵敏、选择性强，不足之处在于无法对三级醇进行衍生化分析。2008年，Mario课题组将这一衍生化方法应用于一种精神活性物质丁丙诺啡的检测分析中。丁丙诺啡是一种合成的吗啡类似物，具有很强的镇痛效果，但因滥用受到了广泛关注。使用LC-MS/MS分析丁丙诺菲缺乏合适的前体离子，但因其分子结构中存在1个游离的酚羟基，Py+试剂可以快速对其进行衍生得到带电荷的衍生化产物离子(m/z559)，并在MS/MS中生成诊断离子m/z443、450。

酰基化试剂在衍生化ESI-MS/MS分析领域的研究中同样活跃。2012年，Saussereau课题组开发了一种磺酰氯衍生化试剂，用于对纳升级血液样本中大麻酚类物质进行快速的LC-MS/MS分析[45]。大麻类代谢物极性较低，缺乏易于离子化的化学基团，在ESI源中离子化效率较差。研究人员利用天然大麻类物质分子结构中存在的酚羟基与磺酰氯试剂发生反应，成功地对纳升级血液样品中的5种大麻酚类物质进行快速灵敏的LC-MS/MS定量分析，反应方程式示于图9。经过条件优化后，最终可在8 min内完成1个样品的LC-MS分析，5种大麻酚类物质的最低定量限(LOQ)为0.25～0.8 μg/L。

图9 磺酰氯与大麻四氢酚(THC)衍生化反应方程式Fig.9 Chemical equation of sulfonyl chloride with THC

2.2.2稳定化学同位素标记的LC-ESI-MS/MS靶向与非靶向分析 常规的LC-MS/MS分析灵敏度高、特异性好，广泛应用于代谢物的定量分析。定量分析方法一般分为外标法和内标法。外标法定量分析的操作相对简单，但其结果受仪器影响波动较大，而使用内标法在样品中加入内标物质进行辅助定量分析可以解决这一问题。因此，选择合适的内标物质十分重要，内标物选择不当会影响内标法定量的准确性。一般来说，同位素内标是最合适的内标物质，但很多类型的代谢物同位素内标难以合成，十分昂贵。常规的LC-MS/MS主要是基于一种靶向的分析手段，即预先知道需要检测的代谢物，然后针对性的进行定性定量分析。目前代谢组学要求从大量复杂的生物样品中非靶向地扫描感兴趣的目标代谢物。为了解决这些问题，稳定化学同位素标记的衍生化试剂提供了一种很好的选择，已成为代谢组脂质组研究的前沿领域。稳定化学同位素标记技术即将衍生化试剂中部分原子使用其稳定同位素标记替换，与原衍生化试剂按照一定的比例混合进行衍生化过程。

2014年，本课题组使用开发的N-烷基吡啶季铵化试剂结合LC-ESI-MS/MS定量分析甲状腺组织中的脂肪醇[52]，具体分析流程示于图10。研究人员使用1对d0/d5-吡啶轻/重同位素试剂进行衍生化实验，使用d0-吡啶进行衍生化实际样品，选用一系列脂肪醇标准品与d5-吡啶反应作为稳定同位素内标，将两者混合送入LC-ESI-MS/MS分析。通过计算每种脂肪醇对应的轻/重同位素衍生化产物质谱信号比值，即可得出相应的脂肪醇在甲状腺组织中的含量水平。该方法快速灵敏、线性范围宽，对各脂肪醇的最低检测限在0.1 μg/L～0.25 ng/L之间，将该方法应用于人正常甲状腺组织和甲状腺肿瘤组织中脂肪醇的定量分析比较，结果表明，多种脂肪醇的含量水平存在显著性差异。

图10 N-烷基吡啶季胺化反应定量分析甲状腺组织中脂肪醇的流程图Fig.10 N-alkylpyridinium quaternization reaction for quantitative analysis of fatty alcohols in thyroid tissues

2016年，加拿大阿尔伯塔大学的Li Liang课题组开发了一种C同位素标记的磺酰氯试剂对醇类代谢物进行广谱非靶向的定量分析[47]。该方法同样使用了一对轻/重同位素标记衍生化试剂，即使用12C/13C标记的1对衍生化试剂，具体分析流程示于图11。使用轻标同位素试剂对样品衍生化，在衍生化反应完成后，首先经过一个液-液萃取过程，使用LC-UV对样品中衍生化的醇类代谢物总含量进行粗略的定量分析。接下来，根据得到的总含量信息向样品中加入一定量的使用重标衍生化试剂标记的标准品池，用于醇类代谢物的非靶向分析和相对定量分析。然后，将该混合物注入LC-MS，根据得到的轻重衍生化产物离子对信息和信号强度比，即可对生物样品中的醇类代谢物进行大规模的定量代谢组学分析。研究人员将该方法应用于人类尿液样品的分析中，结合HMDB等代谢组学数据库，鉴定出2 304个离子对对应的代谢物信息，并对其中的20个代谢物使用标准品进行相对定量分析。

图11 12C/13C磺酰氯试剂对醇类代谢物进行定量代谢组学分析的流程图Fig.11 Workflow of 12C/13C sulfonyl chloride reagent for the quantitative metabolomics of alcohols

2.2.3电喷雾离子源结合离子淌度质谱(ESI-IM-MS)相对定量分析 离子淌度谱(IMS)是近年来新兴的一种物质分离手段，可以基于气相中电场驱动离子在几百毫秒内对多种不同类型的分子进行分离，目前已用于复杂生物样品中多种代谢物的快速鉴定。

2020年，本课题组使用一种N-烷基氯季铵化试剂结合ESI-IM-MS同时对甲状腺组织中的脂肪醇、脂肪醛和甾醇类代谢物进行分析[54]。这项工作将稳定同位素衍生化试剂标记技术与离子淌度质谱有机地结合起来，具体的实验流程示于图12。可见，N-烷基氯季铵化试剂是一种多功能衍生化试剂，可以同时对羟基和羰基进行衍生化反应。在这项工作中，通过轻/重同位素衍生化试剂标记技术，用轻标试剂标记正常甲状腺组织，用重标试剂标记甲状腺肿瘤组织，可以对正常组织和肿瘤组织中的脂肪醇、脂肪醛和甾醇进行相关性分析。另外，使用IM-MS进行分离，增加一维分离度，可以最大限度地消除杂质信号，提高方法的可靠性，示于图13。

图12 N-烷基氯季铵化反应结合IM-MS同时分析脂肪醇，脂肪醛和甾醇Fig.12 N-(1-Chloroalkyl)pyridinium quaternization combined with IM-MS for simultaneous analysis of fatty alcohol, fatty aldehyde and sterol

图13 NCAPQ反应衍生化产物淌度分离图Fig.13 IM paragraph of the derivatized metabolites after NCAPQ reaction

2.3 基质辅助激光解吸附离子源-质谱法

色谱分离技术需要将被分析的样品进行提取纯化等前处理步骤，较为繁琐，且当被分析对象为生物样本时，可能面临着样品量少而不易提取等问题，因此，基于MALDI的检测技术应运而生。然而，一般的醇类代谢物是中性分子，在MALDI 中的电离效率并不理想，近年来，研究者们开发了许多基于MALDI对醇类化合物的衍生化试剂。

2.3.1衍生化MALDI-MS定性和定量分析

注：a.正常人毛发；b.吸毒人员毛发；c.正常组和吸毒组毛发样本经NAPQ反应后所测得脂肪醇含量的比较；○表示d0/d5-PD-16:1;●表示d0/d5-PD-16:0;△表示d0/d5-PD-17:0;▲表示d0/d5-PD-18:2;□表示d0/d5-PD-18:1;★表示d0/d5-PD-18:0;▽表示d0/d5-PD-19:0;■表示d0/d5-PD-20:1;☆表示d0/d5-PD-20:0;◇表示d0/d5-PD-21:0;▼表示d0/d5-PD-22:1;◆表示d0/d5-PD-22:0;◎表示d0/d5-PD-23:0;◢表示d0/d5-PD-24:1;◥表示d0/d5-PD-24:0图14 正常人和吸毒人员毛发内脂肪醇的定性定量检测Fig.14 Qualitative and quantitative detection of fatty alcohols from the hair of normal and drug addicts

本课题组将NAPQ衍生化试剂与基质辅助激光解吸离子化-傅里叶变换质谱(MALDI-FTMS)相结合，用于生物样本毛发中脂肪醇和胆固醇的定性和定量分析，以及尿液样本中醇类和α，β-不饱和酮的类固醇激素的定性分析[55-56]。鉴于FTMS高质量分辨率、高准确度、高灵敏度等特点，利于待测物质的结构解析，另外，MALDI的前处理步骤较简便，无需样品纯化和色谱分离等操作，可满足高通量直接检测的需求，因此，MALDI-FTMS非常适用于复杂生物样本中代谢物的检测。由于在NAPQ试剂中使用了吡啶和氘代吡啶这1对同位素试剂，因此可以通过比较衍生化产物的d0/d5峰进行相对定量分析。本课题组使用该方法成功对正常人和吸毒人员毛发中的脂肪醇进行定量分析，揭示了吸毒人员毛发内脂肪醇含量的降低，为司法鉴定提供了有力的技术支持，示于图14。此外，运用MALDI-FTMS结合NAPQ试剂对正常人尿液样本中类固醇激素进行定性分析，显示出比传统Girard-T更高的灵敏度，为尿液样本分析开拓了新方法。

除NAPQ试剂外，Anthony等[63]使用甲硅烷基化试剂三甲基甲硅烷基咪唑选择性衍生化碳水化合物中的游离羟基，衍生化产物在质谱图上的质荷比相差72 u，这是由于羟基的氢原子被三甲基甲硅烷基取代的结果，这一现象便于在质谱图中识别衍生化产物。此后，该课题组又使用醋酸乙烯酯选择性地衍生化碳水化合物中的羟基，运用MALDI-TOF MS分析O-乙酰化产物，由于1个羟基中的氢原子被乙酰基取代，质谱显示出连续的相差42 u的离子峰，目前该方法已经用于分析多糖和多元醇的单组分和多组分混合物[64]。Vladimir等[65]使用N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺和辛酰氯对聚乙二醇和聚1,2-丙二醇的端基羟基进行衍生化，证实了三甲氧基甲硅烷基化和酰化在确定活性氧基团如(—OH)数量以及聚合物结构解析方面的能力。Zhilyaev等[66]在叔胺存在下用溴甲基氯二甲基硅烷对脂肪醇、萜醇和甾醇进行硅烷基化，以产生含有固定电荷的衍生化产物，便于MALDI分析。Ostah等[67]将异氰酸苯酯用于选择性靶向聚醚多元醇中存在的羟基，以确定活性羟基的数量。Borisov等[68]提出了一种将薄层色谱法和 MALDI 质谱法相结合的色谱后衍生化方法，用于分析醇类和酚类混合物。在过量碱(吡啶或三乙胺)存在下，用 3-溴丙酰氯处理薄层色谱图上的洗脱区，从而完成分析物的化学改性。生成的衍生物包含具有恒定电荷的残留物(铵片段)，确保在 MALDI 期间衍生化分析物从吸附剂层有效解吸。

2.3.2MALDI-质谱成像 质谱成像作为近几年新兴的成像技术，凭借其无需标记、高灵敏度、高通量等优势提供各种体内代谢物在组织内的空间分布，受到研究人员的青睐。MALDI质谱成像由于技术相对成熟、兼具高灵敏度和高空间分辨率，是使用最广泛的质谱成像技术之一。但是，对于MALDI离子源来说，其对含有—OH的中性分子离子化效率较差，因此，开发适合的衍生化试剂对生物样本内的代谢物进行可视化分析极为重要。合适的组织上衍生化试剂与直接在样品管内与生物样本反应的普通衍生化试剂不同，组织上衍生化试剂需要能与生物样本切片中的目标分子发生即时的原位反应，反应后生成衍生化产物的分子质量最好能避开基质分子的出峰区间，且衍生化产物需要比较稳定、易与基质形成结晶便于后续的激光解吸与电离。此外，最佳结晶的大小需控制在20～50 μm之间，为质谱成像提供更好的空间分辨率。

2011年，Caprioli课题组使用1,1′-硫代羰基二咪唑成功地对小鼠肾脏组织内3-甲氧基水杨胺的空间分布进行可视化研究[69]。Bassindale等[57]运用Py+试剂实现了单根头发内Δ9-四氢大麻酚、大麻二酚、大麻酚以及其在体内代谢物四氢大麻酚酸，11-羟基-Δ9-四氢大麻酚和四氢大麻酚葡糖苷酸等大麻素类化合物的MLADI质谱成像，示于图15。Shariatgorji等[70]开发了氟甲基吡啶鎓-8、-9和-10作为衍生化反应的基质试剂，对含有酚羟基的多巴胺能和血清素能系统的几种神经递质(包括其代谢物)进行成像检测，并将该策略应用于帕金森病大鼠和灵长类动物模型，以及人类帕金森病大脑的组织切片模型中。除了以上2种试剂外，Lee等[71]运用4-(二甲氨基)苯基硼酸(DBA)带有叔胺基团的硼酸衍生化试剂对玉米茎、根和叶中的邻二醇代谢物进行衍生化成像，成功检测出10种邻二醇代谢物，并显著提高了其在MALDI中的响应，示于图16。

图15 单根头发中大麻类化合物的衍生化成像Fig.15 Derivative imaging of cannabis compounds in a single hair

图16 玉米叶中邻二醇代谢物的光学图像和质谱图像Fig.16 Optical image and mass spectrometry image of the metabolites of diols in corn leaves

2.4 衍生化直接质谱分析

20世纪初，随着解吸电喷雾离子源(DESI)和实时直接分析离子源(DART)的开发，给质谱研究注入了新的生命力，并由此掀起了敞开式质谱研究的热潮。敞开式离子源的离子化过程在开放的大气环境下即可进行，无需或仅需简单的样品前处理，对样品的性状、种类兼容性高，且可进行在线原位分析。本课题组相继开发了一系列敞开式质谱离子化方法[72-73]。

目前，对于敞开式离子源和原位化学衍生化分析联用来说，主要有以下几方面的应用：1) 在线监测化学反应的过程和机理；2) 收集化学反应的中间体；3) 使分析物的化学衍生化与电离同时发生，以产生具有良好特性的产物，用于后续的质谱分析。Cooks课题组利用解吸电喷雾离子源质谱，实现了通过甜菜碱醛与胆固醇发生亲核加成反应形成半缩醛，且以氘代胆固醇为内标，定量分析血清和动物组织切片中的胆固醇[74-75]。一般的生物样品中能获得的量通常为μL级甚至nL级。目前，在各种质谱离子源中，最适合用于分析微量样品的离子化方法是nano-ESI，其分析的样品所需体积小，去除了ESI的雾化气设置，金属电极施加2～4 kV高压，样品经过电喷雾解脱附带上电荷完成离子化过程。但是，在ESI以及Nano-ESI过程中容易发生氧化还原反应，主要是因为样品溶液与金属电极发生电化学反应。鉴于此，本课题组基于原有的碳纤维(CFI)离子源技术，开发了非接触式微型碳纤维离子化(noncontact nano-CFI)，示于图17。该装置对极性与非极性样品都具有较好的离子化能力，且在一定程度上弥补了基于ESI原理的离子源带来的样品易发生氧化还原反应的缺点。利用这一特点，本课题组将noncontact nano-CFI与NAPQ试剂联用，提出了一种“on-probe”的快速衍生化方法，并将其应用于单细胞内甾醇的衍生化分析，该衍生化反应直接在Pico-Glass-probe内部进行，无需任何反应后处理。选择CH2Cl2作为单细胞代谢物甾醇和磷脂的萃取溶剂，对待测物质进行最大程度地提取，避免信号损失，极大地提高了甾醇检测的灵敏度和数据的可靠性。另外，衍生化也改善了甾醇代谢物的二级质谱行为，有助于甾醇的定量分析[53]。

图17 非接触式微型碳纤维on probe衍生化用于分析单细胞内甾醇 Fig.17 On probe noncontact Nano-CFI derivatization for the analysis of sterols in single-cell level

Borisov等[76]使用实时直接分析离子源质谱(DART-MS) 对伯/仲醇和含氮碱(吡啶、喹啉)进行原位分析反应，为检测和鉴定不同来源的单个一元醇、分析不同基质中的植物甾醇和其他甾醇提供了快速、灵敏的方法。

3 总结与展望

醇类代谢物广泛存在于生物体内，对其分析研究是代谢组学的重要组成部分。目前，借助于各种化学衍生化试剂和质谱仪，大幅提升了对醇类代谢物的检测能力。通过新兴的稳定同位素衍生化技术，可以快速、简便地对醇类代谢物进行内标法定量、非靶向的代谢组学分析。衍生化质谱成像技术的引入，使检测组织表面各区域醇类物质含量的变化成为可能。各种直接分析质谱技术与衍生化试剂相结合，使醇类代谢物的质谱分析变得更加快速简便，大规模、高通量的生物样品分析成为可能。最后，微量质谱分析技术的发展甚至能够在单细胞水平分析醇类代谢物的变化。这些研究成果使人欣喜，同时也激励着研究人员继续开发更先进的质谱衍生化技术，更全面地对生物样品中醇类代谢物进行分析研究。