微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药研究中的应用

庞 博，刘 舒，刘志强，刘淑莹，宋凤瑞

(1.中国科学院长春应用化学研究所，长春质谱中心&吉林省中药化学与质谱重点实验室，吉林 长春 130022；2.天津市产品质量监督检测技术研究院，天津 300384)

中医药历经几千年的发展，在疾病的预防和治疗方面发挥了重要作用。然而，由于中药成分的复杂性以及体内过程的多样性，早期中药相关研究受分析技术及方法学的制约。20世纪80年代出现的电喷雾电离质谱技术，将液相色谱与质谱相结合，极大推进了中药现代化的发展进程。特别是液相色谱-质谱联用技术与各种生物分析技术的不断融合，大大扩展了质谱技术在现代中药研究及生命科学领域的应用范围，如微透析-液相色谱-质谱联用技术将微透析实时、原位取样的特点，与液相色谱-质谱联用技术的快速分离、结构表征的优势相结合，近年来被广泛用于中药活性成分的筛选、中药药代动力学及作用机制等方面的研究[1-5]。本文将对以上应用进行概述。

1 微透析技术简介

微透析是以膜透析原理为基础的微量生物活体动态连续取样技术[6]，早期主要用于神经科学领域。近年来，微透析技术已被成功应用于许多组织器官及体液的研究[4,7-9]。微透析取样技术的原理图示于图1。实验中选取与细胞外液组成相似的生理溶液作为灌流液，将含有半透膜结构的探针插入采样组织，在灌流液恒速灌注过程中，由于半透膜两侧存在浓度差，小分子物质可以沿浓度梯度逐渐扩散并被灌流液不断带出，而蛋白质等生物大分子及与蛋白结合的非游离型药物则不能通过半透膜，从而达到取样的目的[10-11]。

图1 微透析取样示意图Fig.1 Scheme of microdialysis sampling

微透析系统通常是由微量灌流泵、探针、连接管和样品收集器组成。其中，微透析探针是微透析系统的核心部件，不同的探针膜长、内径、截留分子质量范围等参数可适用于不同的取样环境。根据探针构造的不同，一般可分为线性探针、同心圆式探针、柔性探针和分流探针。线性探针主要适用于肝脏、肌肉、皮肤和脂肪等外周组织取样。同心圆式探针是应用最多的一类探针，主要用于脑内神经科学研究，通常需要利用脑立体定位仪选定特定脑区，并在探针套管的引导下植入采样部位。柔性探针的形态与同心圆式探针相似，但柔性更好，可随实验动物活动而弯曲，对取样部位的组织损伤降到最低，适用于肌肉、皮肤、脂肪、血管和眼部等软组织取样，在血管中的应用最普遍，已广泛用于清醒动物的药代动力学研究。分流探针主要用于胆汁取样，可避免取样过程中的体液损失，并可实现长时间采样。实际应用过程中，除了微透析探针的选择，灌流液的组成、浓度、pH值等条件也要与细胞外液等渗且相近，并以恒速灌流，这样可有效减少探针采样部位周围细胞外液组成的变化及其他物质的干扰，组织损伤较轻，在采样过程中基本无体液损失[12-13]。

利用微透析技术既可以实现对同一组织的实时、连续监测，也可以对不同组织或体液的多个位点进行监测，包括内源性及外源性物质[2-5]。在药物研究中，可以观察到药物在体内一定时间段的实时情况，有利于获取药物在体内的动力学信息[2-3,14-15]。通过微透析，使用较少的实验动物就能够获得大量的实验数据，减少了所需实验动物的数量，有效降低了因动物个体差异而产生的实验误差。

由于通过微透析技术获得的样品量非常有限，待测物会受到体内生理环境等因素的影响，使常规分析技术的灵敏度和选择性难以满足要求。现代分析技术与微透析的离线及在线联用大大拓宽了微透析技术的应用领域，特别是高效液相色谱-质谱联用技术兼具快速、灵敏、高选择性等优点，与微透析技术的联用使中药复杂体系的研究如虎添翼。

2 微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药研究中的应用

2.1 微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药活性成分筛选中的应用

中药活性成分与中药的质量和疗效密切相关。由于复杂的基质干扰，中药活性成分的筛选及表征非常困难。微透析技术能够利用半透膜将中药小分子与蛋白等生物大分子分离。根据中药小分子与生物体内靶分子间特异性结合的特点，微透析-液相色谱-质谱联用技术通过比较有无生物靶分子加入时，溶液中处于游离状态的中药小分子浓度的变化来推断其与靶分子之间的结合程度，并同时对与靶分子结合的中药成分进行结构表征。利用该方法，Wang等[1]通过微透析取样与液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用，从栀子提取物中筛选出23种潜在的醛糖还原酶抑制剂。在缓冲液中作为生物靶分子的醛糖还原酶与中药小分子结合形成复合物后，被微透析探针截留在膜外，未结合的中药小分子则由于浓度梯度被灌流液带出，进入透析液，示于图2。该实验分别收集栀子提取物和栀子提取物与醛糖还原酶共同孵育后的透析液，利用高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)鉴定与醛糖还原酶结合的化合物，并计算出筛选的化合物与醛糖还原酶抑制剂的结合率。Pang等[16]以α-糖苷酶为生物靶点，建立了微透析结合液相色谱-串联质谱法快速筛选黄芩提取物中α-糖苷酶抑制剂。Zhang等[17-18]以α-葡萄糖苷酶为靶分子，采用微透析-强度衰减质谱法对栀子及黄芩提取物的入血成分及代谢产物活性进行分析，确定了入血原型成分及代谢物与α-葡萄糖苷酶的结合亲和力大小，该方法能排除复杂基质的干扰，有利于快速确定栀子及黄芩提取物中调节血糖的活性成分。

图2 微透析-液相色谱-质谱联用技术筛选栀子中醛糖还原酶抑制剂的示意图[1]Fig.2 Schematic diagram of screening aldose reductase inhibitors in Gardenia jasminosides by microdialysis-LC-MS[1]

此外，Lei等[19]以土荆皮提取物和汉防己提取物与人乳腺癌细胞MCF-7相互作用为例，利用微透析技术取样筛选中药中多种活性成分。利用半透膜结构的探针分别从中药提取物以及提取物和细胞共孵育后的体系中取样，通过对比LC-MS分析得到的指纹图谱中各成分的丰度差异，初步筛选出与细胞相互作用的活性成分，该研究巧妙地利用了微透析取样技术能够排除大分子物质干扰，仅小分子物质扩散至膜内的特点，简化了样品处理过程，实现了中药活性成分的快速辨识。上述研究表明，微透析-液相色谱-质谱联用技术可针对特定的疾病靶点(分子、细胞)对中药活性成分进行高通量筛选，有利于从分子、细胞水平阐明药物的作用机理，为疾病治疗和新药研发提供依据。

2.2 微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药体外代谢研究中的应用

由于中药成分复杂，其在体内发挥的疗效和产生的毒副作用受代谢过程的影响很大。因此，明确中药的代谢途径及过程并结合药理活性研究，不仅可以为合理用药提供参考，也可为新药的研发奠定基础。与体内代谢研究相比，中药的体外代谢模型可以排除体内复杂环境的干扰，更直接地对代谢过程进行监测，可在短时间内获得大量的代谢产物，为进一步阐明药物的作用机制提供数据支持。其中，肝微粒体代谢和肠内菌培养是研究药物体外代谢的两种重要模型。

肝脏是药物代谢的主要器官，肝微粒体含有大量的细胞色素P450(CYP450)，主要催化药物肝脏Ⅰ相代谢[20-21]。Wen等[22]通过微透析取样结合液相色谱-飞行时间质谱研究了毛蕊异黄酮和芒柄花黄素在大鼠肝微粒体中的代谢和药物相互作用。通过该方法检测并鉴定了与肝微粒体共同孵育后来自毛蕊异黄酮的2种羟基化代谢产物，以及来自芒柄花黄素的3种羟基化产物或4′-O-去甲基化衍生物。研究还发现，毛蕊异黄酮和芒柄花黄素会对CYP450酶反应产生抑制作用，当2种化合物共同存在时，抑制彼此的Ⅰ相代谢。

大量研究表明，肠道菌群在口服中药的代谢过程中发挥着重要作用[23-24]。中药成分经过肠道菌群代谢产生丰富的代谢产物，对其生物活性具有重要影响。因此，研究中药的肠内菌代谢对了解其代谢途径、深入阐释其体内过程具有重要意义。肠内菌群以厌氧菌群为主，目前常用的体外肠内菌代谢研究方法是将中药提取物与肠内菌在厌氧培养箱中培养[25-26]。Li等[27]通过设计简化的厌氧培养装置，利用在线微透析结合超高效液相色谱-质谱联用技术(MD-UPLC-MS)解决了传统的体外肠内菌代谢取样过程，对厌氧菌群的厌氧环境及肠内菌群微生态环境造成的影响，并利用该方法对黄芪皂苷Ⅱ在肠内菌中的代谢过程进行实时监测。实验中通过在灌流液中加入2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)，有效降低了基质干扰，提高了方法的灵敏度。在黄芪皂苷Ⅱ的肠内菌代谢实验中，共检测到6种新物质，其中4种为中间产物。与常规方法相比，利用online-MD-UPLC-MS建立的中药成分肠内菌代谢研究方法，不仅操作简单，还可实现肠内菌培养、取样、样品前处理和实时在线操作的目的。

2.3 微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药体内吸收代谢研究中的应用

中药在体内发挥药理作用，要经过复杂的机体吸收和代谢过程。因此，需要在体外代谢研究的基础上进一步探究其体内过程。Xue等[28]采用微透析结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)同时鉴定口服藿香提取物在血液和肾脏透析中的成分，通过微透析探针分别植入颈静脉和肾髓质，连续采集微透析样品，转移至微管，采用UPLC-Q-TOF MS进行分析，确定了大鼠血液循环中和肾脏中的非结合成分。Cao等[29]利用微透析-液相色谱-质谱联用技术快速、灵敏地分析山茱萸在大鼠微透析液中的原型及代谢产物，根据特征诊断碎片离子和分子质量信息，确定生物转化位点，并对代谢物进行结构鉴定，首次在大鼠体内发现山茱萸的7个原型化合物和3个新的代谢物。Liu等[30]通过微透析取样联合超高液相色谱-四极杆-飞行时间质谱分析了知母皂苷提取物在大鼠血液中的活性成分及代谢产物。Zheng等[31]利用微透析技术与LC-MS联用研究了青藤碱在大鼠皮下含量的实时监控方法，发现青藤碱皮下的第一阶段生物转化可能包括去甲基化和羟基化过程。该方法可以提供真实药物在作用部位的代谢情况，有助于研究青藤碱的代谢机理。Zhao等[32]应用改进的胆汁微透析取样技术结合液相色谱-四极杆-飞行时间质谱研究中药复方二妙丸在SD大鼠胆汁中的代谢变化。根据精确质量和碎片信息，鉴定出23种生物碱和内酯代谢物，其代谢途径涉及葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、羟基化和水解，阐明了二妙丸在体内的代谢特征。

2.4 微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药药代动力学及药代动力学-药效学研究中的应用

中药药代动力学是在中医药理论的指导下，通过药代动力学原理，研究中药活性成分在体内吸收、分布、代谢和排泄，以及在体内的药物浓度随时间的变化规律。由于采样技术的限制，早期的药代动力学研究多用血液样本进行分析，而微透析取样技术与液相色谱-串联质谱的联用不仅可以实现几乎所有组织的取样，还能利用质谱的高选择性和高灵敏度的特点，解决生物样品的内源性干扰多、目标成分含量低的问题，因而，被广泛用于中药的药代动力学研究[33-34]。Zheng等[35]采用微透析取样结合液相色谱-串联质谱方法，比较了黄芪桂枝五物汤中芍药苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-6-葡萄糖苷和姜酚这4种成分在正常大鼠和脑缺血再灌注损伤大鼠的血液和脑中的药代动力学行为。研究表明，脑缺血可影响体内药物代谢，增加血液中芍药苷和姜酚的含量，降低毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮-7-O-β-D-6-葡萄糖苷的含量。Mi等[36]利用血脑双位点微透析技术结合液相色谱-质谱联用法，比较了在血瘀型偏头痛模型大鼠中不同浓度天麻素和天麻苷元对川芎嗪和阿魏酸药代动力学的影响。发现不同浓度的天麻素和天麻苷元会明显影响川芎嗪和阿魏酸的药代动力学；天麻素和天麻苷元可以增加川芎嗪和阿魏酸的脑靶向性。与其他传统采样方式相比，离线微透析取样大大简化了样品的前处理步骤，且可以同时进行多个位点、多个部位的微透析取样，获得丰富的药代动力学及组织分布信息。但在采集、储存以及浓缩等过程中，依然存在样品的污染、降解等问题，并且离线微透析方式往往受分析系统对样品量要求的限制，需要在获得较好探针回收率的前提下，牺牲一定的样品时间分辨率以实现成功进样。

为更好地解决此类问题，在线微透析分析系统应运而生，将采集到的样品直接注入包括分离和检测设备的分析系统中，具有许多超越离线微透析的优势。但微透析取样时间短，在线液相色谱-质谱仪需要具有超快的色谱分离速度，以及高灵敏度的质量检测能力。而商品微透析接口耐压较低，不适合与超高效液相色谱-质谱联用。因此，本课题组自行设计研制了耐96.53 MPa高压的在线接口，并将其应用于中药药代动力学[37-38]及作用机制等方面的研究[3,5]。如Wang等[3]构建了急性不完全性脑缺血模型，利用在线微透析-液相色谱-串联质谱联用方法研究刺五加叶中主要成分的脑内代谢动力学过程及其对脑缺血大鼠脑内神经递质的影响。发现刺五加叶中的金丝桃苷和1,5-二咖啡酰奎宁酸均能成功透过血脑屏障到达脑部, 并能有效缓解由缺血引发的神经递质水平紊乱，实现了在不同离子监测模式下对内源性及外源性物质的同时、实时、连续检测。Zhang等[37]利用在线微透析-超高效液相色谱-串联质谱(MD-UPLC-MS/MS)法研究了栀子4种未结合环烯醚萜在健康和2型糖尿病大鼠血液中的药代动力学，发现2型糖尿病大鼠的药代动力学行为明显改变；在不需要标准品的条件下，采用MD-UPLC-MS /MS方法直接、实时测定栀子环烯醚萜提取物在2型糖尿病大鼠体内主要代谢物genipin-1-O-glucuronic acid和genipin-monosulfat的相对含量，获得了两者的相对药动学参数[38]。与离线微透析-液相色谱-质谱联用技术相比，在线微透析-超高效液相色谱-质谱联用技术具有更高的时间分辨率，可以实现实时监测，减少样品在采集、转移和储存过程中可能造成的污染、降解等问题；简化样品处理过程，避免处理小体积样品带来的困扰，实现自动分析；在线联用系统还能够获得更好的稳定性和重现性[39]。

此外，血、脑微透析-超高效液相色谱-串联质谱法也可应用于氨溴索与远志联合用药的药物相互作用研究[39]，结果表明，远志提取物与氨溴索联合的给药方案是安全的，且不存在药代动力学相互作用。

药代动力学-药效学 (PK-PD) 关联分析可以将药物在体内的动力学过程与其对机体的效应关联起来，有助于全面系统地阐明药物的作用机制，为药物筛选、药物毒性预测、临床剂量方案选择提供了重要的研究方法和理论依据[40-44]。Zhan等[45]通过建立一个简单的自由运动大鼠血液微透析取样系统，结合液相色谱-串联质谱研究了生脉注射液对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌缺血NO实时释放的PK-PD效应。Wang等[46]搭建了微透析-超高液相色谱-三重四极杆质谱联用的在线分析平台，通过PK-PD关联分析研究了刺五加叶治疗缺血性脑中风的药效物质基础和作用，示于图3。该研究搭建的在线分析平台可同时、连续采集和定量检测清醒状态下缺血性脑卒中大鼠的血浆和海马区脑脊液中刺五加叶的6种活性成分，以及与缺血性脑卒中有关的8种神经活性物质，建立了一种可视化的方法来表达缺血性海马区药代动力学和药效学之间的关系，证明了刺五加叶对缺血性脑卒中有多方面的调节作用。

图3 基于在线微透析-高效液相色谱-串联质谱技术的PK-PD分析示意图[46]Fig.3 Schematic diagram of PK-PD analysis based on online microdialysis-LC-MS/MS[46]

2.5 微透析-液相色谱-质谱联用技术在中药代谢组学及作用机制研究中的应用

中药多成分、多靶点及多途径作用的特点为中药现代化研究带来了极大的挑战。近年来，随着代谢组学的不断发展，利用代谢组学进行中药的药效物质基础、安全性评价和药理作用机制等方面的研究，符合中药多成分、多靶点的特点，有利于理解中药在体内发挥的整体疗效。微透析-液相色谱-质谱联用技术能够充分发挥微透析取样“实时、活体、微量、微创”的特点，以及液相色谱-质谱联用技术的高通量、高灵敏度和高特异性的特点，为代谢组学研究提供了新视角[4,47-48]。

类风湿性关节炎是最常见的自身免疫性疾病之一，其特征是持续性滑膜炎和异常滑膜增生。类风湿性关节炎的局部炎症可以改变关节滑液的化学组成，显著加速慢性炎症的发展和向全身炎症变化的进程。Zhan等[48]利用微透析技术解决了关节滑液的取样困难，应用亲水相互作用液相色谱与高分辨质谱联用(HILIC-HRMS) 技术研究了佐剂性关节炎大鼠的代谢特征和京尼平苷治疗的潜在机制。通过多元统计分析发现，佐剂性关节炎大鼠与正常大鼠的20种代谢物存在显著差异，京尼平苷治疗可以回调其中13种代谢物的变化。本实验室利用微透析颈静脉和肾脏双位点取样技术，结合基于液相色谱-串联质谱联用技术的靶向代谢组学方法，分别筛选出血液和肾脏中栀子治疗糖尿病肾病的生物标志物，并阐释其作用机制，示于图4[4]。此外，本实验室利用自行设计的在线接口，采用在线微透析-超高效液相色谱-质谱联用方法监测糖尿病脑病大鼠海马区的8种神经活性物质的含量变化，对刺五加[3]、黄连[5]、人参[49]、北五味子[50]治疗糖尿病脑病的作用机制进行了深入研究。

图4 双点微透析靶向代谢组学示意图[4]Fig.4 Schematic diagram of the targeted metabolomics by dual-probe microdialysis[4]

3 结语

微透析-液相色谱-质谱联用技术将微透析技术在活体、实时、连续取样的特点与质谱技术的快速、灵敏、特异性强等优点融合，有效解决了中药体系复杂、内源性干扰众多、活性成分及代谢物在生物样品中浓度较低等问题，在中药活性成分筛选、药物代谢、药代动力学及作用机制等研究方面发挥了其他技术不可比拟的优势，为中药现代化研究提供了一条新的途径。但由于微透析取样量少、影响探针回收率等原因，单纯依靠微透析-液相色谱-质谱联用方法研究中药中含量跨度较大的众多成分的体内过程，以及它们的整体作用机制尚存在一定的局限性，需要与其他方法相结合，发挥各自优势，形成完整的研究体系。

目前，微透析-液相色谱-质谱联用技术在中医药研究领域的应用还不够广泛，除上述提到的应用外，期待该技术能够解决中药剂型的改良、中药制剂的靶向给药、中医药理论及临床研究中的瓶颈问题，使之成为中医药传承和创新研究的有力工具。相信随着现代分析技术的不断发展，以及多学科技术和手段的交叉融合，微透析-液相色谱-质谱联用技术会在中药现代化研究中发挥更重要的作用。