电感耦合等离子体质谱在细菌多组分分析中的应用

张钰清，孙公伟，邢 志，张四纯，张新荣

(清华大学化学系，北京 100084)

细菌在微生物种群活动与人体健康的关系、微生物致病研究中占据着重要的位置[1]。大量研究表明，除了侵入人体的细菌会直接或间接导致多种疾病，人体内细菌群落的组成结构也会对人体的激素水平、血压调控，甚至癌症治疗产生影响[2]。为了深入研究细菌及其产物对生物体的作用，研究者们对精准、快速的细菌检测、鉴定和分型方法有了越来越高的需求[3-5]。

常用的细菌检测方法有生化染色法、核酸测序法、电化学检测法、荧光标记法、酶联免疫检测法、质谱检测法等[6-16]。生化染色法和核酸测序法是早期细菌鉴定的金标方法。前者主要通过观察菌落形态和细菌细胞壁特殊分子的生化染色结果，识别菌株种类；后者则是通过对细菌核酸的扩增检测和基因测序来确定细菌的种类。但是这两种方法对细菌的纯度要求较高，需要在细菌的分离培养上花费大量时间，难以实现对混合细菌的快速检测[5]。电化学法、荧光标记法、酶联免疫法大多依靠细菌的特异性抗原或者特征核酸片段识别细菌，根据反应前后电信号或光信号的变化表征细菌的数量。虽然检测成本较低且检测速度快，但在进行多组分检测时会受到限制。电化学法和酶联免疫法不适用于多组分的同时检测，而荧光法虽然有多种荧光标记基团可供选择，但在实际进行多组分检测时，不可避免的光谱重叠会限制可同时使用的荧光探针数量[17-19]。

结合元素标记策略的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法通过对标记元素的直接检测，可实现生物样品的多组分定量分析[20]。2001年，本课题组提出了结合元素标记策略的ICP-MS免疫分析法[21]。随后，ICP-MS被进一步用于生物样品中蛋白质、核酸等多种生物分子的定量分析[22-27]。ICP-MS对大多数金属元素的检测具有灵敏度高、线性范围宽、可多元素同时定量等优势，且可仅通过质荷比识别元素种类，不要求元素标记，具有特殊的光、电、磁特性[28-30]。同时，作为标记的每种无机元素信号对应唯一的生物分子，元素探针之间一般不会互相干扰，且可以采用同位素比值进行校正，有效地保证了检测结果的准确性和可靠性[31]。此外，还可使用金属纳米粒子标记、结合多种信号放大方法，提高检测的灵敏度。使用ICP-MS分析细菌样品时，细菌的特征代谢物、蛋白质和核酸片段均可作为待测对象，用于判断细菌的种类并表征其种群数量。本文将综述目前ICP-MS在细菌分析方面的应用，并对相关研究的发展方向和前景进行展望。

1 细菌的ICP-MS检测方法

ICP-MS很难直接对不含特殊金属元素的生物分子进行检测，但对于无机元素有着极高的灵敏度和宽线性范围的定量能力。利用这一特性，既可以使用元素标签标记目标分子，通过相应标记的元素信号对目标分子进行定量检测，也可通过检测某些特殊细菌细胞内无机元素含量来识别特定细菌。选取生物体自身不含有的金属元素作为标记，能实现目标物质的绝对定量分析。不同标记元素在ICP-MS检测时会产生彼此独立的信号峰，通常不存在谱线重叠问题，适合进行多组分检测。为了更有效地识别细菌种类和确定浓度，采用ICP-MS检测细菌时，大多会选择蛋白抗原、特征核酸片段等可进行特异性识别的生物大分子作为目标物。

得益于对核酸序列和蛋白标志物结构的深入研究，这些特征大分子物质的元素标记更加高效。通过抗原-抗体识别、生物正交反应、核酸互补杂交等特异性结合策略，目标分子会与元素标记的蛋白或核酸探针高效地结合，随后只需根据标记元素的信号强度就可以判断相应目标分子的含量。ICP-MS检测细菌时的样品前处理过程更简单，结果更简洁明晰，且在鉴别种类的同时，能提供定量信息，适用于混合细菌的种群研究。这类直接检测方式无需细菌纯化培养，得到的细菌定量结果有可能更接近于种群原始的组成状态[32]。

1.1 细菌中金属元素的ICP-MS检测方法

细菌自身含有的一些无机元素，和从外界环境中富集的元素都能被ICP-MS检测到，作为细菌鉴定的依据。细菌吸收的金属元素会存在于细菌的一些功能性蛋白质中，帮助维持细菌结构稳定，也会用于维持细菌内外渗透压平衡或作为细菌生存的能量物质，通过检测细菌细胞的金属元素种类和含量，可对细菌进行区分和鉴定[33]。

ICP-MS对痕量元素的检测能够达到pg/g～ng/g的超低检出限。2004年，Schaefer等[34]使用直接注射法对不同种类的芽孢杆菌进行ICP-MS直接检测，分析了多种无机元素在细菌细胞内的含量，证明了不同种类的细菌由于其生长历史和生理功能的差异，其细胞内无机元素含量的指纹图谱存在差异。

2009年，Poole等[35]使用激光解吸电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)对大肠杆菌菌落内多种金属元素的分布进行原位检测，发现磷、锰、锌、铁、钙等元素在同一菌落中的空间分布存在差异，并且提出了ICP-MS用于研究细菌生物膜形成过程的可能性。

随后，有研究使用ICP-MS分析了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌、绿脓杆菌、绵羊李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌等6种细菌体内镁、锰、铜等23种无机元素的富集程度，发现不同细菌含有的无机元素浓度分布有较大区别，通过分析不同细菌富集的无机元素的指纹谱图，可以明显地区分这6种细菌[36]。2016年，Lu等[37]通过分析含10种特征元素的指纹图谱，鉴别了30种食源性细菌。Huang等[38]将微渗析采样技术与ICP-MS检测结合，对处于不同生长阶段的细菌进行动态监控。通过对细菌培养液中钴、铜、钙等元素的定量分析，发现不同生长阶段的细菌对于这些金属元素的摄取量存在明显差异。

1.2 细菌核酸特征片段的ICP-MS检测方法

将元素标记核酸检测策略用于细菌核酸检测，可以在不进行核酸扩增的情况下，实现以核酸特征片段为依据的细菌定量检测。得益于近年来ICP-MS核酸检测分析方法的发展，细菌特征核酸片段的检测效果能逐渐满足实际细菌样品的检测需求。细菌的DNA和核糖体RNA(rRNA)上的特征片段是常用的待测物[39]。且由于核糖体RNA在细菌细胞中的含量很高，与细胞功能相关的特征基因序列信息较丰富，是目前常用的目标物[8,40-42]。

ICP-MS可以直接对DNA链中含有的元素进行定量。比如，可以使用ICP-MS的碰撞反应池测定磷的质量分数来反映基因组DNA的定量结果[43]。由于DNA的分子结构会直接呈现出磷的含量，所以通过DNA测序数据，可以将ICP-MS分析结果转化为DNA基因组单元数。采用该方法对嗜肺军团菌基因组DNA进行检测，其结果与常用的紫外分光光度法、荧光染料法和实时荧光定量PCR的分析结果基本一致[44]。

使用标记探针可以实现对细菌核酸更有针对性的定量分析。Sun课题组[45]使用金纳米颗粒标记的核酸探针和磁分离技术，实现了对致病微生物特征核酸的ICP-MS定量检测。随后，Hu课题组[46]报道了一种简便、灵敏的福氏志贺氏菌ICP-MS检测方法，即用生物素修饰的捕获探针和金纳米标记探针，通过核酸杂交法实现目标细菌靶向DNA的鉴定。Jiang课题组[47]结合DNA/RNA的三明治杂交反应、单分子磁捕获和单颗粒电感耦合等离子体质谱信号放大技术，建立了一种新型16s rRNA检测方法。包被在磁性微球表面的捕获抗体可以特异性地与待测物结合，而连接在金纳米颗粒表面的核酸探针可在紫外光下解离。由此，该方法只需经过磁分离和紫外照射两步，即可完成待测物的分离富集和标记的解离。纳米粒子进入ICP-MS时，脉冲信号频次与金纳米粒子浓度呈线性关系，由此可计算出待测RNA浓度。该方法可直接检测对人类有致病风险的病原体的RNA，并能对目标物进行高精度定量分析，检出限可达10 fmol/L。

2020年，本课题组[48]提出使用稀土元素标记的核酸探针对细菌核酸特征片段进行多组分检测的ICP-MS分析方法，用于混合细菌样品的定量检测。该方法利用S1核酸酶处理方法高效提取特征片段，用磁分离方法对待测核酸片段进行捕获分离，结合稀土元素标记策略，通过核酸探针杂交法对待测组分进行标记检测，实现了对6种肠道相关细菌的同时鉴定，并在不进行纯化培养的情况下，对细菌数量进行定量检测。

1.3 细菌蛋白标志物的检测方法

使用ICP-MS检测蛋白质或者多肽时，大多需要给待测物加上金属元素标签。常用的标记方法有化学修饰标记法和免疫亲和标记法。化学修饰标记法主要依靠细菌蛋白或多肽上含有的特殊基团(可以是天然存在的，也可能是通过人工培养使细菌表达出来的)，通过化学反应带上标记。为了在保证标记效率的同时尽量使细菌的存活率和生理状态不受影响，化学修饰法一般会选择低危害的生物正交反应进行标记[49]。而免疫亲和标记法则是通过抗原抗体的亲和反应使细菌带上元素标签。免疫亲和反应是一种高效无害的温和反应，对细菌特征蛋白具有较高的特异性识别[21]。但是筛选特异性抗体非常耗时，很难保证需要检测的所有细菌都能找到对应的特异性抗体。为解决这一问题，由于核酸适配体具有可控的结构和识别能力，也被用于特征蛋白的免疫标记。

化学修饰标记大多需要培养细菌以使其细胞结构带上特殊的高反应效率基团。Wang课题组[50]于2019年首次报道了一种用于计数和识别单个细菌细胞的镧系元素编码的ICP-MS检测方法，示于图1。他们将炔基修饰的D型氨基酸(aDA)添加到多种菌株的培养基中进行培养，使细菌细胞壁中带上大量这类炔基修饰的氨基酸。通过炔基和叠氮的点击反应，在细菌的细胞壁上连接含铕元素(Eu)的标记物。这样单个细菌细胞能够产生超过5个数量级的信号扩增，在使用单颗粒电感耦合等离子体质谱(SP-ICP-MS)检测时，可被视为分散的含Eu颗粒。同时，通过免疫反应使细菌标记上不同镧系元素编码的多克隆抗体，检测时作为特异性细菌的鉴定信号识别细菌种类。

注：a.细菌的化学修饰和免疫标记；b.使用SP-ICP-MS进行细菌分类计数图1 镧系元素标记细菌细胞计数示意图[50]Fig.1 Scheme of lanthanide labeled bacterial cell count[50]

使用抗体通过免疫反应对细菌进行特异性标记，是细菌蛋白质ICP-MS检测的一种常用策略。为了直接检测细菌时得到更好的检测效果，通常会选择纳米粒子作为元素标记[51]。2010年，文献[52]报道了一种快速、灵敏的检测大肠杆菌的方法，采用抗体亲和反应、金纳米颗粒标记和ICP-MS检测策略，将修饰了特异性抗体的金纳米颗粒作为亲和探针识别大肠杆菌上的特征抗原，随后根据ICP-MS测出的金纳米颗粒浓度对细菌细胞进行定量分析。利用金纳米颗粒的信号放大特性和ICP-MS的高灵敏度，该方法在40 min内即可完成检测，且检出限达到500 CFU/mL。2015年，Hamme课题组[53]报道了类似方法，使用金纳米标记的亲和抗体对沙门氏菌进行定量分析，检出限为100 CFU/mL。

磁性分离是元素标记ICP-MS检测中常用的分离方法。通过使待测物吸附或偶联在磁性固体表面，在磁场作用下可以快速有效地将待测物从复杂基底中分离，增加检测的灵敏度和结果的准确性。这种磁免疫分析策略也可用于细菌特征蛋白和表面抗原的ICP-MS检测。2018年，Lim课题组[54]利用新合成的多核磁性纳米粒子，建立了伤寒沙门氏菌的磁分离ICP-MS免疫分析方法，可对伤寒沙门氏菌进行绝对定量检测。该方法的独特之处在于使用掺杂铯的磁性纳米粒子进行分离和检测，实现了快速、高灵敏度的分析，且结果可靠。用填充了25%聚乙二醇的微管对磁性纳米粒子-斑疹伤寒反应产物进行磁电泳分离，随后用ICP-MS测定，可以实现分离和检测的连续进行。

结合了信号放大策略的ICP-MS免疫分析方法，可以在检测细菌表面标志蛋白时得到更高的灵敏度。如使用金纳米颗粒标记的杂交链式反应，对微生物的检出限可达0.12 μg/L[55]。

细菌从环境中摄取的金属元素有时可以反映细菌生长的状态和生存历史[56-57]。结合元素标签的质谱流式细胞分析方法(CyTOF)已被广泛用于细胞分型研究中[58-60]，进行高通量的细菌分型和计数[61]，并且还能提供单个细菌内金属元素的含量。2017年，Muller等[62]使用流式细胞仪对细菌进行单细胞水平检测，使用钌红和顺铂共同标记区分样品中活细胞和死细胞，并进行细胞计数，示于图2。同时使用ICP-MS检测单个活细胞中的银元素，检出限可达到1.5 fg。由于同种细菌不同个体细胞中的银含量可以反映细菌所处的生理状态，用此方法能够快速检测出生长和不生长的恶臭假单胞菌细胞，并分选出其中生长状态良好和活性不足的菌株。

注：a.细胞经染色和标记后用CyTOF检测；b.正常培养和饥饿培养的细胞Ru信号差异区分；c.使用顺铂标记区分出的死细胞(Q2)和活细胞(Q3)；d.使用荧光流式细胞仪区分出的死细胞(R2)和活细胞(R3)图2 使用CyTOF检测细菌流程示意图[56] Fig.2 Scheme of bacterial detection process using CyTOF[56]

2 结论与展望

近20年来，基于ICP-MS检测的生物分子的多组分分析方法不断发展，得以满足更多细胞、细菌等生物样品的定量分析需求。结合元素标记策略的ICP-MS检测方法，目前已经可以对混合细菌样品进行多组分同时分析。且随着对细菌研究的深入和检测技术的发展，越来越多的生物标志物被筛选出来，作为目标待测物用于细菌检测。然而，现有的细菌ICP-MS分析工作仍较少，且应用范围大多局限在实验室研究中，主要原因在于未经纯化培养的实际样品细菌检测难度较大。一方面受限于细菌分析可用的目标物质。免疫分析通常会选择位于细菌细胞壁上或是分泌到细胞外的目标物，但是并非所有细菌都能筛选出特异性较高的蛋白、多肽类生物标志物，现在可以直接检测的细菌特征标志物种类有限。而细菌的特征核酸序列虽然更容易筛选，但是由于核酸大多存在于细胞内部，检测前需要较为复杂的提取过程，耗时更长，因此需要发展更便捷的样品前处理方法高效地提取目标核酸片段。另一方面则是细菌定量分析效果会受限于分析方法的灵敏度。在对细菌含量极低的实际样品进行检测时，仍然会存在难以检出的问题。因此需要研制信号响应性更好的元素标记，结合多种信号扩增方法使ICP-MS检测能够更好地满足低浓度混合细菌分析的需求，才能进一步将其推广到生物医药领域的应用中。

结合元素标记策略的ICP-MS细菌分析方法，可以快速定量同一群落中不同细菌的数目，得到更接近群落原始状态的细菌组成结构。同时，使用ICP-MS免疫分析方法还能有效地检测细菌的毒性因子、化学信息素等特殊分泌物，反映细菌对外界环境刺激的响应方式。因此，在微生种群的快速鉴定、微生物相互作用研究方面，ICP-MS检测仍有较大的发展空间和应用前景。