Aloxe3在非酒精性脂肪肝中调控作用及其分子机制

孙菲 苏维玮 李佳 刘晓刚

(1山东大学齐鲁医院(青岛)肝病科/感染病科，山东 青岛 266000；2唐山市工人医院肝胆外科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明确的肝损伤因素外所致的以肝细胞内脂质过度沉积为主要特征的临床病理综合〔1〕，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关的肝硬化。单纯性脂肪肝指的是肝脏脂质含量超过肝脏体积的5%，随着肝脏脂质沉积的增多，肝脏炎症随之发生。NASH是单纯性脂肪肝的下一阶段〔2〕，其在一般人群中的发病率为3%～5%，NASH患者在进展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌方面具有更高风险〔3〕。非酒精性脂肪肝是与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢性肝病，与肥胖、胰岛素抵抗和高血糖密切相关〔4,5〕。随着2型糖尿病和肥胖症患病率增加，非酒精性脂肪肝成为一种比酒精性脂肪肝更常见的脂肪肝〔6〕，患病率约占总人群的30%〔7〕，因此探究NAFLD发病机制，为其防治提供一定的理论基础，具有重要的临床意义。

脂氧合酶(Aloxe)3基因可编码一种新型代谢调控蛋白即表皮型Aloxe3〔8〕。研究报道，通过对患有非大疱性先天性鱼肌样红皮病家族进行连锁不平衡分析发现Aloxe3基因突变和非大疱性先天性鱼肌样红皮病有关〔9〕。随后研究发现Aloxe是一个氧化不饱和脂肪酸如花生四烯酸等特定的过氧化物的含铁蛋白酶家族，Aloxe3蛋白即其中的一个独特的可催化特定的环氧醇类生成的环氧醇合酶。相关研究证实，过表达Aloxe3可改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗〔10〕，Aloxe3作为一个潜在的肝细胞禁食反应的效应调控分子〔10〕，是代谢性疾病尤其是糖尿病治疗中的重要代谢靶蛋白。研究发现，在禁食、葡萄糖饥饿或海藻糖/海藻糖类似物治疗期间，Aloxe3基因被激活并介导了肝脏饥饿相关代谢反应〔10,11〕。然而目前关于Aloxe3在脂肪肝中的作用机制仍不清楚，本研究探究Aloxe3在脂肪肝中的具体作用机制，为NAFLD治疗尤其脂肪肝药物研发发掘潜在的分子靶向位点。

1 试剂和方法

1.1试剂 脂质(油红O)染色试剂盒(货号：0080-1)购买自默克公司，Aloxe3过表达病毒和Aloxe3干扰病毒均购自上海吉凯生物，脂质检测试剂盒包括三酰甘油(TG)检测试剂盒、总胆固醇(TC)检测试剂盒购自南京建成生物有限公司，货号分别为A110-1、A112-1。β-羟基丁酸检测试剂盒购自R&D公司，货号为R2302-A。逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂均购自日本东洋纺TOYOBO公司，货号为FSQ-101和FSQ-115。Aloxe3抗体购自上海晅科生物科技有限公司，货号141-240，tubulin抗体购自Santa公司，货号为13022。

1.2高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠饲养 16只雄性5周龄C57/BL小鼠购自南京模式动物中心，体重16～18 g，小鼠饲养在无特定病原体(SPF)动物房中，饲养环境温度为20～24℃，日温差≤3℃，相对湿度达50%～650%，新鲜空气换气次数10次/h，日照12 h昼夜循环。适度适应性喂养1 w后随机分为对照组和高脂饲料组，每组8只，高脂饲料组开始高脂饲料喂养，高脂饲料购自Research Diet公司，对照组为普通饲料喂养。

1.3基因型肥胖(ob/ob)小鼠的饲养 8只雄性8周龄ob/ob小鼠及8只野生型对照小鼠购自南京模式动物中心，体重22～26 g，小鼠饲养在SPF动物房中，饲养环境要求同高脂饲料喂养小鼠，ob/ob小鼠及其对照组小鼠普通饲料喂养与1.2中小鼠一样，8 w后，苯巴比妥钠麻醉小鼠，心尖心搏最明显处穿刺取血，4℃ 2 500 r/min离心10 min，取小鼠肝脏冻存于-80℃用于后续检测。

1.4Aloxe3过表达病毒感染野生型小鼠 16只雄性6周龄C57/BL小鼠购自南京模式动物中心，体重18～20 g，小鼠饲养在SPF动物房中，饲养环境要求同1.2。适度适应性喂养1 w后所有小鼠开始高脂饲料喂养，每周称量小鼠体重，连续喂养7 w后，随机分为对照组和Aloxe3过表达组，每组8只，Aloxe3过表达组尾静脉注射5×1010pfu/ml Aloxe3过表达腺病毒，对照组给予同等剂量的对照载体病毒，给予病毒后每周检测一次小鼠体重及进食量，4 w后，苯巴比妥钠麻醉小鼠，心尖取血，4℃ 2 500 r/min离心10 min，同时取小鼠肝脏并称量肝脏重量，然后取50 mg肝脏保存于组织包埋剂(OCT)保存液中用于冰冻切片油红O染色，其余肝脏冻存于-80℃用于后续检测。

1.5Aloxe3 shRNA下调小鼠肝脏中Aloxe3表达 20只雄性6周龄C57/BL小鼠购自南京模式动物中心，体重18～20 g，小鼠饲养在SPF动物房中，饲养环境要求同方法1.2。适度适应性喂养2 w后随机分为对照组、Aloxe3干扰组，每组10只，小鼠尾静脉注射1×1011pfu/ml Aloxe3 shRNA干扰腺病毒，对照组给予同等剂量的对照载体病毒，6 w后，两组饥饿16 h，称量小鼠体重，然后苯巴比妥钠麻醉，心尖取血，4℃ 2 500 r/min离心10 min，同时取小鼠肝脏并称量肝脏重量，取肝脏冻存于-80℃用于后续检测。

1.6血清和肝脏中的脂质含量 称取50 mg肝组织放入装有研磨珠的2 ml离心管，加入0.5 ml预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)，将离心管放入组织样品研磨机中60 Hz、120 s震荡研磨，加入1 ml氯仿-甲醇溶液(体积比为2∶1)，充分振荡混匀，2 500 r/min离心10 min，离心后剥离上层组织片，上层为水相，吸取下层有机相至另一新的1.5 ml离心管中，离心管敞开盖子，通风橱中干燥过夜，然后利用无水乙醇溶解干燥后的脂质，用TG及TC检测试剂盒检测血清和肝脏中的脂质含量。TG及TC的检测方法参照南京建成公司试剂盒操作说明进行。

1.7酮体水平检测 利用β-羟基丁酸检测试剂盒检测小鼠血清中酮体β-羟基丁酸，样品均采用复孔检测，减少操作导致的误差。操作根据试剂盒说明进行，大致步骤如下：每孔加入血清样品100 μl(10倍稀释)，然后加入样品反应液，37℃反应30 min后，加入终止液 450 nm处检测每孔的吸光度(OD值)。

1.8油红O染色 用OCT包埋剂浸没的肝脏组织在液氮中保存，然后在冰冻切片机中切成厚度为10 μm的冰冻切片，然后用4%多聚甲醛固定10 min，其次用蒸馏水洗，60%异丙醇浸洗分化，油红O染液染色10 min，60%异丙醇分色至背景无色后蒸馏水洗2遍，苏木素复染，蒸馏水洗后甘油明胶封片，然后显微镜下观察肝脏切片油红O染液阳性区域并拍照。油红O属于偶氮染料，可与TG结合，油红O染液阳性区域表示脂质沉积区域。

1.9实时荧光定量PCR 提取肝脏总RNA，加总RNA抽提剂(TRIZOL)试剂1 ml，震荡碾磨摇匀，加氯仿0.2 ml，轻摇15 s，室温静置2～3 min后，12 000 r/min，4℃离心15 min。然后取上清无色水相到EP管中加0.5 ml异丙醇，室温下静置10 min，12 000 r/min，4℃离心10 min。弃去上清后75%乙醇洗涤总RNA白色沉淀，7 500 r/min，4℃离心5 min，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解总RNA，测RNA浓度后利用逆转录试剂盒逆转录，最后利用DNA结合染料(SYBR)和随机引物进行实时荧光定量PCR，检测基因的表达。引物序列如下：Aloxe3 正义：5′-TACACTGCATCAGCTGCATC-3′；反义：5′-CG CTCGCTCGCTATCAGCTG-3′。SREBP1正义：5′-CT CGTAGCATGATATCGAGT-3′；反义：5′-ATCGCTGGTATCGATGTACA-3′。FASN正义：5′-ATGCTGAACA GTGTACACAAT-3′；反义：5′-ACGCGTGTCAGCTAGC TAGCTT-3′。PPARα正义：5′-AGCTACAACTCGCTGCATGAT-3′；反义：5′-CAATCAGTCAGCATCGATAC-3′。CPT1α正义：5′-CGTACGTACGTACGATGCT AG-3′；反义：5′-ACGCATGATGACTAGATCC-3′。AC OX1 3正义：5′-CGCGCGTAGCATGATCGTG-3′；反义：5′-ACGTGATCGATGTGGCACC-3′。HMGCS2正义：5′-ACAAGATGCTCTGAGAGAGCC-3′；反义：5′-CATCGATGTGACATC TAGAGAGC-3′。SCD1正义：5′-CGATGTGCTGTCGAGACTACCCA-3′；反义：5′-ACGACTGACTAGTATCTGCGATTC-3′。GAPDH正义：5′-ACTGCATGCATGTGTCATCAGCGA-3′；反义：5′-CCGCGCTAGCT GCATGTACGCAGTC-3′。

1.10Western印迹 用组织快速裂解液(RIPA)裂解肝脏组织并在组织破碎仪震荡，12 000 r/min 4℃离心20 min，取上清进行蛋白浓度测定，然后上样80 V恒压电泳，以120 V恒压将蛋白电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含有5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭PVDF膜1 h。封闭结束后，在含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST中用相应的一抗孵育4℃过夜，二抗室温结合2 h，加入显影液曝光显影，分析目的蛋白的表达量。

1.11统计学方法 采用GraphPad Prism6.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组脂肪中Aloxe3表达 高脂饲料组小鼠肝脏中TG的含量显著高于对照组(P<0.001)。高脂饲料组mRNA水平和蛋白水平均显著低于对照组(P<0.001或P<0.01)，见表1。

表1 两组肝脏中的Aloxe3表达

2.2ob/ob脂肪肝小鼠中Aloxe3表达 ob/ob小鼠组肝脏中TG含量显著高于对照组(P<0.001)。ob/ob小鼠组mRNA、蛋白水平均显著低于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 ob/ob脂肪肝小鼠中Aloxe3表达

2.3过表达Aloxe3的小鼠体重和摄食量的改变 Aloxe3过表达组肝脏中Aloxe3的mRNA和蛋白水平〔(4.68±0.73),(3.89±0.69)〕显著高于对照组〔(1.03±0.05),(1.11±0.08);P<0.01或P<0.001〕，表明Aloxe3过表达成功。Aloxe3过表达组Aloxe3过表达前，两组体重无明显差异，在Aloxe3过表达病毒感染1 w后，Aloxe3过表达组体重即开始明显低于对照组(P<0.05)，在Aloxe3过表达的第2、3、4周，两组差异明显增大(P<0.01或P<0.001)。而两组摄食量未见明显差异(P>0.05)，提示Aloxe3可能参与调控机体的能量代谢率。见表3。

表3 过表达Aloxe3的小鼠体重和摄食量改变

2.4过表达Aloxe3的小鼠脂质代谢的改变 Aloxe3过表达组肝脏脂质沉积量显著低于对照组(P<0.01)。见图1。Aloxe3过表达组肝脏TG、血清TG和TC含量显著低于对照组，而酮体β-羟基丁酸含量显著高于对照组(P<0.01)，表明Aloxe3过表达可降低小鼠血脂，促进酮体生成，改善肝脏脂质沉积。见表4。

图1 过表达Aloxe3的小鼠肝脏脂质沉积水平(油红O染色，×200)

表4 过表达Aloxe3的小鼠肝脏脂质代谢的改变

2.5Aloxe3可促进脂质分解和脂肪酸氧化 Aloxe3过表达后肝脏脂质合成相关基因胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)1、脂肪酸合酶(FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)1的表达无明显变化，而肝脏脂质氧化分解相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α、肉毒碱棕榈酰基转移酶(CPT)1α、过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶(ACOX)1的表达均显著高于对照组(P<0.01或P<0.001)。酮体生成基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGCS)2的表达显著高于对照组，表明Aloxe3主要通过上调脂质分解和脂肪酸氧化，促进酮体生成，增强小鼠的脂质分解代谢率。见表5。

表5 过表达Aloxe3小鼠肝脏脂质代谢相关基因的表达

2.6Aloxe3下调后小鼠脂代谢的改变 Aloxe3 shRNA腺病毒感染后的小鼠肝脏中Aloxe3表达较对照组显著降低(P<0.001)，见图2、表6，表明Aloxe3 shRNA腺病毒下调效果明显。Aloxe3 shRNA腺病毒感染小鼠饥饿16 h后肝脏TG含量也显著增加(P<0.001)。同时血清脂质包括TC和TG含量显著升高(P<0.001)，Aloxe3干扰组血清β-羟基丁酸水平显著低于对照组(P<0.05)，见表6，说明Aloxe 3参与调控肝脏脂质代谢，尤其是脂肪酸氧化和酮体生成水平。

图2 Aloxe3 shRNA病毒感染后Aloxe3在小鼠肝脏中的表达

表6 Aloxe3下调后小鼠脂代谢的改变

3 讨 论

Aloxe3基因是一种编码表皮型脂氧合酶eLOX3，有研究表明〔10〕Aloxe3基因被激活并介导了肝脏饥饿相关代谢反应，是一种潜在的治疗性禁食反应的新型效应物，提示Aloxe3基因可能参与了机体脂质代谢的调控。为此本文首先在饮食诱导和ob/ob小鼠脂肪肝模型中检测Aloxe3的表达，发现Aloxe3在上述两个脂肪肝模型中均表达下降。在小鼠中过表达Aloxe3，发现Aloxe3不仅可降低小鼠体重，还可抵抗高脂诱导的小鼠脂肪肝。这与此前的研究结果一致，过表达Aloxe3可增强db/db糖尿病小鼠的基础产热、改善胰岛素抵抗〔10〕，提示过表达Aloxe3可能改善小鼠糖脂代谢。

肝葡萄糖饥饿反应作为一种治疗途径，可增强肝脏和整个宿主的代谢率〔12〕，目前得到越来越广泛的应用〔13，14〕，而这些代谢调控的作用机制仍不清楚。本研究发现小鼠在摄食量未明显改变的情况下，高脂小鼠体重降低，脂肪肝改善，同时酮体生成水平增加，即过表达Aloxe3小鼠表现为肝葡萄糖饥饿反应。同时Aloxe3可增强肝脏脂质代谢，减轻脂肪堆积和体重增加，并降低血液中的TG和TC水平。提示Aloxe3可能是肝葡萄糖饥饿反应的重要介导因子。然而对Aloxe3是否引起热量燃烧增加、促进机体的代谢率改变，将是以后研究的重点，下一步将利用代谢笼加以探究。

新的研究发现，天然海藻糖可激活Aloxe3的表达以提高机体胰岛素敏感性，从而降低2型糖尿病的发病概率〔15，16〕。有研究表明，通过饮水的方式喂食小鼠海藻糖会对其肝脏糖脂代谢功能带来有益的影响〔17〕，其效果类似于饥饿〔15～18〕，但是对于海藻糖引起的小鼠脂代谢的改善是否通过Aloxe3目前尚无相关研究，应进一步研究海藻糖可否调控肝脏特异性Aloxe3敲除小鼠的糖脂代谢改变。研究表明当肝脏PPARγ特异性敲除后，Aloxe3介导的增强胰岛素敏感性的作用即消失，因此Aloxe3主要通过PPARγ-PGC1α通路来提高肝胰岛素敏感性〔10〕。Aloxe3作为一个潜在的依赖PPARγ的禁食反应效应调控分子〔19〕，在脂代谢中的作用尤其在脂肪酸氧化和酮体生成中的作用〔20〕，是否依赖PPARγ目前尚不可知，本研究结果显示PPARα在Aloxe3过表达后其水平亦显著上升，可推测Aloxe3的脂质代谢改善作用可能是依赖PPARα，这有待进一步研究。